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《生物工程进展》2000 ,Vol . 20 ,No . 5 技术与方法 cDNA 文库固相构建法 　　　 王义琴 　孙勇如 ( 中科院遗传所 　北京 　100 10 1) 摘要 　本文介绍一种 cDNA 文库的固相构建法 。文库构建过程 cDNA 的合成和修饰全部在固相介 质 —磁珠上完成 ,简便 、迅速 、文库质量高 ,能满足不同目的的 cDNA 文库构建 ,是一种值得借鉴和 应用的好方法 。 关键词 　cDNA 库 　固相构建 　磁珠 　　 ( Kris N lambert 1993 , Yasnory F Sasaki et al . 1994) , 但局限之处是oligo (D T) 与纤维素 、胶粒或磁珠的结 1 　前言 合比较牢固 ,将 cDNA 洗脱下来时得率不是很高 ,而 七十年代中叶首例 cDNA 克隆问世以来 ,构建 且以后的反应步骤也不能都在介质上进行 ,这可能 cDNA 文库已成为获取 目的基因的基本手段之一 。 是该技术应用并不十分广泛的原因。 文库构建最重要的就是获得完整的文库 ,为了达到 最近 Thomas Roeder 提出了一种新的 cDNA 文 ( ) 这一 目的 ,在 mRNA 提纯 、cDNA 合成等方面 , 出现 库固相合成方法 Thomas Roeder 1998 , 克服了以 了许多技术和方法 ,并大大改进了载体系统 。目前 前文库构建中存在的缺点 ,所用的酶和试剂与传统 许多公司都有现成的 cDNA 试剂盒出售 ,用少量的 方法完全相同 ,不同的是 cDNA 的合成和修饰均在 ( ) mRNA 即可照例建立起一个 内容丰富的 cDNA 文 固相支持物 ———磁珠 magnetic beads 上完成 ,使一 ( 库 。其中较为出色的有 Amer sham Pharmacia 公司 天建库的工作更为轻松 。现将该方法简介如下 见 的 TimerSaver cDNA 合成试剂盒 ,将 cDNA 文库的 图 1) : 构建缩短为一天 ,实现了一天建库的愿望 。虽然如 5′端生物素化的oligo (D T) 25 —Primer 中含有 ( 此 ,cDNA 的合成和克隆尚非易事 ,仍是件费钱 、费 一段 Not I 的识别序列 5′biotinGA GA GA GA GA 力的工作 。 GA GC GGCC GC T25 G/ A/ C3 ′) ,连接在链霉亲和素 为了满足不同的应用需要 , 目前已有许多构建 包被的磁珠上 ,将总 RNA 与磁珠混合后 ,mRNA 便 文库的方案可供选择 。但所有的方案都有一个共同 与oligo (d T) 25 结合 ,通过磁性吸附 ,可一步分离磁 的操作流程 ,即通过 oligo ( d T) 结