第3章 流式细胞技术与流式细胞仪.pptVIP

第十一章 流式细胞技术与流式细胞仪; 本章内容提要;概述 ;流式细胞仪的定义:流式细胞仪是以激光为光源，集流体力学技术、电子物理技术、光电测量技术、计算机技术以及细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的新型高科技仪器。 ;流式细胞术的定义:应用流式细胞仪对于处在快速直线流动状态中的细胞或生物颗粒进行快速的、多参数的定量分析和分选的技术称为流式细胞术。 ; 生物学颗粒包括大的免疫复合物、DNA、RNA、蛋白质、病毒颗粒、脂质体、细胞器、细菌、霉菌、染色体、真核细胞、杂交细胞、聚集细胞等，所检测的生物颗粒的理化性质包括细胞大小、细胞形态、胞浆颗粒化程度、DNA含量、总蛋白质含量、细胞膜完整性和酶活性等。; 1934年：Moldavan; 1934年Moldavan 使悬浮的血红细胞从一个毛细玻璃管中流过，每个通过的细胞可被一个光电装置记录下来，这可谓流式细胞仪的最初模型。 ; 1965年Kamentsky用紫外吸收和可见光散射两个参数同时测量未染色的细胞，给出了细胞中核酸的含量和细胞大小，奠定了多参数流式细胞测量的基础。; 1967年Van Dilla 和Los Alamos采用了Crosland-Taylor设计的层流流动室和氩离子激光器开发出了液流束、照明光轴，检测系统三者互相垂直的流式细胞仪，成为目前各种流式细胞测量仪的基础。 ; 1969年Fulwyler利用Sweet的静电墨水喷射液滴偏转技术，建立了流式细胞分选术。Ehrlich和Wheeless利用飞点扫描技术和缝扫描技术使零分辨率的流式细胞仪变成了低分辨率的流式细胞仪。 ; 80年代以来，流式细胞仪的数据采集、存储、显示、分析日趋完善，随着样品制备方法的增多，新的荧光染料和细胞标记物的出现，流式细胞仪的应用范围逐渐扩大。 ; 进入90年代，标本制备仪和自动进样器的问世，以及适合临床应用的单克隆抗体的增加，使流式细胞仪不仅出现在大专院校和科研单位，它也逐渐进入医院的中心实验室和检验科。 ;第一节 流式细胞仪的工作原理;1.样品的进入流动室：将悬浮分散的单细胞悬液，经特异荧光染料染色后，放人样品管。在气体压力的作用下，悬浮在样品管中的单细胞悬液形成样品流垂直进入流式细胞仪的流动室，沿流动室的轴心向下流动。;2.鞘液的作用：流动室轴心至外壁的鞘液也向下流动，形成包绕细胞悬液的鞘液流，鞘液和样品流在喷嘴附近组成一个圆柱流束，自喷嘴的圆形孔喷出，与水平方向的激光束垂直相交，相交点称为测量区。 ;3.信号的产生与接收：染色的细胞在测量区受激光照射后发出荧光，同时产生光散射。这些信号分别被光电倍增管和光电二极管接收，经过计算机储存、计算、分析这些数字化信息，就可得细胞的大小和核酸含量等指标。; 当某类细胞的特性与要分选的细胞相同时，流式细胞仪就会在这类细胞形成液滴时给含有这类细胞的液滴充以特定的电荷，带有电荷的液滴向下落入偏转板间的静电场时，依所带电荷的符号分别向左偏转或向右偏转，落入指定的收集器内。;第二节 流式细胞仪的分类和基本结构;第二节 流式细胞仪的分类和基本结构;第二节 流式细胞仪的分类和基本结构;第二节 流式细胞仪的分类与结构 ;第二节 流式细胞仪的分类和基本结构;第二节 流式细胞仪的分类和基本结构; 由于激光焦点处能 量分布为正态分布（见 图），中心处能量最高。 因此，当样本速率选择 高速时，处在样本流不 同位置的细胞或颗粒， 受激光照射的能量不一 样，从而被激发出的荧 光强度也不相同。 ;（二）激光光源与光束成形系统 激光是一种相干光源，它能提供单波 长、高强度及稳定性高的光照。由于细胞 的快速流动，每个细胞经过光照区的时间 仅为1μs左右，且细胞所携带荧光物质被 激发出的荧光信号强弱，与被照射的时间 和激发光的强度有关，因此细胞必须达到 足够的光照强度。 ;（三）光学系统 FCM的光学系统是由若干组透镜、滤光片和 小孔组成。 滤光片主要分为： 1.长通滤光片 长通滤光片使特定波长以 上的光通过。 2.短通滤光片 特定波长以下的光通过。 3.带通滤光片 带通滤光片允许一定波长 范围内的光通过;（四）信号检测与分析 当细胞携带荧光素标记物，通过激光 照射区时，细胞内不同物质产生不同波长 的荧光信号。这些信号以细胞为中心，向 空间360度立体角发射，产生散射光和荧光 信号。;（四）信号检测与分析 1.散射光信号 散射光分为前向角散 射和侧向角散射，散射光不依赖任何细胞 样品的制备技术(如染色)，称为细胞的物 理参数（或称固有参数）。 （1）前向角散射 前向角散射与被测细胞 的大小有关 （2）侧向角散