辐射诱发基因组不稳定性肝细胞Ran基因过表达和RNAi模型的构建.pdfVIP

第 44卷第 2期第 180页 华 中科技大学学报 (医学版) V01．44 No．2 P．180 2015年 4月 ActaMedUnivSciTechnolHuazhong Apr． 2015 辐射诱发基因组不稳定性肝细胞 Ran基因过表达 和 RNAi模型的构建* 原雅 艺， 党旭红 ， 刘红艳 ， 刘建功 ， 左雅慧△ 中国辐射防护研究院，太原 030006 摘要：目的 构建基因组不稳定细胞 Ran基因过表达和 RNAi模型，为进一步研究该基因在辐射诱发基因组不稳定 的功能提供研究工具。方法 根据 Ran基因信息 ，以慢病毒载体 GV218设计合成 2种重组质粒，分别包含 Ran基因全 长序列以及阴性对照序列；以慢病毒载体 GV248设计合成 2重组质粒，分别包含 Ran基因的小干扰序列以及用于干扰 对照的阴性序列 。利用 Westernblot和 qPCR进行过表达和 RNAi重组质粒表达 的检测 ；通过转染 293T细胞进行慢病 毒的包装 ；利用 qPCR和荧光法分别进行滴度 的检测 ；再用包装好 的慢病毒感染辐射诱导基 因组不稳定性 HL一7702肝细 胞 ，利用 qPCR检测 Ran基因表达量 。结果 测序结果表 明重组质粒构建成功，并能够有效转染 293T。过表达病毒滴 度为 2．0×10Tu／mL；RNAi病毒滴度为 3．0×10TU／mL。过表达慢病毒能有效地上调 Ran基 因的表达 ，过表达效率 为 85 。RNAi干扰慢病毒能够有效抑制 Ran基 因的表达 ，抑制效率为 73 。结论 成功构建基 因组不稳定肝细胞 Ran基因过表达和 RNAi模型，为进一步研究Ran基因在辐射诱发基因组不稳定细胞中的功能提供了有效的研究工具。 关键词：Ran基因； 过表达； RNA干扰 ； 慢病毒载体 中图分类号 ：R349．6 DOI：10．3870／j．issn．1672—0741．2015．02．012 ConstructionofRan oVerexpressiOnandRNAiM odelsofRadiation-induced GenomicUnstableHepatocytes Yuan Yayi，DangXuhong，Liu Hongyanetal ChinaInstituteforRadiationProtection，Taiyuan030006，China Abstract Ohieetive ToconstructRanoverexDressionandRNAimodelsofgenomicunstablecellsinanattempttoprovide aneffectivetoolforexploringthefunctionofRan inradiation—inducedgenomicinstability．M ethods AccordingtoGenBank，a full—lengthcDNA sequenceofRanandanegativesequenceweredesigned，synthesized，andtheninsertedintoplasmid GV218 lentiviralvector．Moreover，aninterferingsequencetargetingRanandanegativesequenceweredesigned，synthesized，andthen insertedintoplasmidGV248lentiviralvector．W esternblotandqPCR wereused，respectively，tomeasuretheRanoverexpres— sionandRNAirecombinantplasmids．Thevira1packagingwasperformedbytransfectioninto293T cells．Thevirustiterwas testedbyq