siRNA抑制SKOV3细胞Her2-neu表达及细胞增殖的动物实验研究.doc

　　siRNA抑制SKOV3细胞Her2/neu表达及细胞增殖的动物实验研究 ：程志祥, 周颖, 朱园园, 肖敏, 高宗侠, 祝怀平, 凌斌 【摘要】 　　目的: 通过卵巢癌细胞株SKOV3细胞增殖及动物荷瘤实验探讨siRNA沉默Her2/neu基因的表达效果。方法: 靶向Her2/neu 的siRNA经脂质体LipofectAMINE2000介导转染到SKOV3中, 通过嘌呤霉素筛选得到稳定抑制Her2/neu基因表达的SKOV3/siRNA细胞株, 通过RTPCR和免疫组化方法检测Her2/neu基因抑制效果, 运用四甲基偶氮唑蓝(MTT)检测各组细胞增殖水平并将SKOV3/siRNA细胞接种到裸鼠皮下检测荷瘤情况。结果: 建立了稳定抑制Her2/neu基因表达的细胞株SKOV3/siRNA, RTPCR和免疫组化结果显示Her2/neu基因表达受到较强抑制, MTT检测结果显示SKOV3/siRNA组细胞增殖较SKOV3明显下调（Plt;0.05）, 其接种在裸鼠皮下形成的肿瘤生长速度明显减慢（Plt;0.05）。结论: 靶向Her2/neu基因的siRNA可以抑制卵巢癌细胞株SKOV3在体外和体内增殖, 有望成为卵巢肿瘤 治疗 的新途径。 【关键词】 Her2/neu基因 RNA干扰 卵巢肿瘤 　　Her2/neu基因是人类肿瘤中常发生异常改变的基因之一, 定位于人类染色体17q21, 编码Mr为185000的蛋白, 命名为p185[1]。Her2/neu（p185）受体属于受体酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinase, RTK）超家族, 其过度表达可以赋予卵巢癌、 乳腺癌等肿瘤细胞更高的恶性生物学行为, 且与肿瘤的化疗敏感性及预后呈明显的负相关[2]。 RNA干扰(RNA Interference, RNAi)是指在生物体细胞内, 外源性或内源性的双链RNA引起与其同源mRNA的特异性降解, 因而抑制其相应基因表达的过程。本研究中利用RNAi技术, 用脂质体将靶向Her2/neu基因的siRNA转染入卵巢癌细胞株SKOV3, 建立了稳定抑制 Her2表达的SKOV3/siRNA细胞株, 并探讨其体外增殖特性及在动物体内的成瘤力, 以期为逆转肿瘤细胞恶性生物学行为的研究提供动物实验基础。 　　 1 材料和方法 　　1.1 材料 SKOV3细胞株购自上海细胞所, McCoy’s 5A改良培养基、 胎牛血清为Gibco公司产品（SKOV3细胞在37℃ 50 mL/L CO2饱和湿度下培养）; BALB/c系雌性裸小鼠(14只, 8周龄, 质量20～25 g), 购自上海实验动物中心; 脂质体LipofectAMINE2000、 总RNA提取试剂TRIzol购自Invitrogen公司; 逆转录试剂盒购自Promega公司; Taq DNA聚合酶购自华美生物工程有限公司; siRNA载体、 上、 下游引物由上海生工合成; 免疫组化试剂盒SAP9102和Her2/neu小鼠抗人单克隆抗体（mAb）购自北京中杉金桥生物技术有限公司; 四甲基偶氮唑蓝（MTT）为Sigma 公司产品。 　　1.2 方法 　　1.2.1 人卵巢癌细胞株SKOV3细胞培养与siRNA转染 对数生长期SKOV3细胞按1×105/孔移至6孔板以含100 mL/L胎牛血清的McCoy’s 5A改良培养液培养。实验对照组不转染siRNA, 转染试验组转染siRNA质粒。细胞80%融合时进行转染。转染按照LipofectAMINE2000说明书进行, 4 h后更换完全培养液, 48 h后更换含嘌呤霉素的完全培养液筛选培养, 每3～4 d换液, 约20 d后筛选成活并完全汇合的细胞, 传代培养。转染组细胞株命名为SKOV3/siRNA。 　　1.2.2 RTPCR检测Her2/neu基因mRNA的表达 提取各组SKOV3细胞的总RNA, 按逆转录试剂盒说明逆转录成cDNA, 逆转录体系25 μL。随后行PCR反应, 以βactin为内参, Her2/neu上下游引物为5′TGCGGCTCGTACACAGGGACTT3′和5′TGCGGGAGAATTCAGACACCAACT3′, 反应体系为25 μL, 产物大小420 bp, βactin大小500 bp。10 g/L TAE琼脂糖凝胶电泳检测。 　　1.2.3 免疫组化检测p185蛋白的表达 将细胞分别接种在置有无菌处理过盖玻片的6孔板中, 细胞融合80%时收获细胞爬片, 采用免疫组化检测p185蛋白的表达, 通过SAP9102试剂盒检测, Her2/neu mAb稀释度为1∶100, DAB显色, 细胞质或膜出现棕褐色为阳性染