IL12和IL10与实验性自身免疫性脑脊髓炎大鼠发病的相关性.doc

　　IL12和IL10与实验性自身免疫性脑脊髓炎大鼠发病的相关性 ：檀国军, 徐 玉, 王秀丽, 朱一飞, 刘静, 郭力 【摘要】 目的: 探讨IL12及IL10与实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)大鼠发病的相关性。方法: 以豚鼠全脊髓匀浆与福氏完全佐剂为抗原免疫S)是临床常见的中枢神经系统(central nervous system, S)炎性脱髓鞘的自身免疫性疾病。实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis, EAE)是CD4+T细胞介导的S自身免疫性脱髓鞘疾病, 是MS的经典动物模型。目前MS的发病机制尚不清楚, Karpus等［1］认为与Th1/Th2失衡有关。研究表明, Th1与Th2类细胞因子(cytokine, CK)的表达分别与EAE病情进展和缓解相关［2］。本研究通过观察EAE大鼠血清中IL12、 IL10水平变化, 目的在于探讨IL12及IL10与EAE发病的相关性, 以期为深入了解MS的发病机制、 探索新的有效 治疗 途径和病情的监测提供理论依据。 1 材料和方法 1.1 材料 雌性a公司; IL12、 IL10双抗体夹心ELISA试剂盒购自上海森雄科技实业有限公司。 1.2 方法 1.2.1 动物分组法 将健康、 雌性al saline, NS)对照组: 18只, 仅注射NS, 分组同CFA组。 1.2.2 完全抗原的制备 健康350～400 g雌性豚鼠5只用100 g/L水合氯醛350 mg/kg腹腔注射至四肢瘫软, 迅速取其全脊髓。按1 g脊髓∶1 mL NS在冰槽中用超声细胞粉碎仪制成500 mL/L的豚鼠全脊髓匀浆(guinea pig spinal cord homogenate, GPSCH), 与等量含4 g/L卡介苗的CFA充分混合至油包水乳剂, 制成完全抗原。 1.2.3 建立EAE大鼠模型及临床评分 EAE组经大鼠四肢足垫皮下注射抗原匀浆0.4 mL/只, 佐剂组为CFA代替抗原匀浆同法注射, 正常对照组皮下均注射NS。记免疫当日为第0天, 进行临床症状评分, 参照Kono等［3］提出的标准, 分为5级: Ⅰ级动物尾部无力; Ⅱ级尾部无力+肢体无力; Ⅲ级肢体轻度麻痹; Ⅳ级肢体严重麻痹, 被动翻身后不能复原; Ⅴ级濒死状态。 1.2.4 组织病 理学 检查 所有动物于免疫后在不同的时间点处死, 留取血清, 麻醉后先以NS左心室冲洗, 再用40 g/L多聚甲醛灌注固定, 切取大脑视交叉层面2 mm脑组织、 小脑、 脑干、 颈膨大、 胸段及腰膨大脊髓固定于40 g/L多聚甲醛中, 石蜡包埋切片, 行HE染色。 1.2.5 ELISA检测 血清IL12、 IL10水平的表达, 用双抗体夹心ELISA检测。 1.2.6 统计学分析 采用SPSS11.0统计软件进行统计分析, 数值用x±s表示, 单因素多组比较用方差分析, 两组之间比较用t检验, 症状评分间比较用相关分析。 2 结果 2.1 EAE大鼠的发病情况 EAE组大鼠免疫后出现精神萎靡、 食欲减退、 皮毛不光滑, 自第10天开始发病, 症状表现为不同程度的尾部张力消失、 无力; 第14天进入发病高峰, EAE组动物全部发病, 发病率为100%, 此期症状最严重, 双后肢甚至四肢无力、 麻痹, 大小便失禁, 一只动物因病情严重而死亡, 平均症状评分3.88±0.68; 至第21天动物症状缓解, 体质量也逐渐恢复(图1)。CFA组和NS组大鼠没有发病, 状态及体质量无明显变化。 2.2 病理组织学检查 EAE组发病大鼠脑脊髓组织HE染色可见, 在其发病早期S内有单核淋巴样细胞散在浸润; 发病高峰期S内大量的单核淋巴样细胞浸润, 尤其在小血管周围形成典型“袖套样(cuffing)”改变(图2), 提示血脑屏障( bloodbrain barrier, BBB)被严重破坏; 缓解期S内单核淋巴样细胞浸润程度明显减轻。病变累及部位涉及大脑、 小脑、 脑干、 脊髓等, 以白质为主。CFA组和NS组大鼠脑和脊髓均未见异常。 图1 EAE大鼠免疫后临床症状评分 图2 血管套袖样改变 (HE, ×400) 2.3 血清IL12水平的变化 EAE组血清中IL12在潜伏期(注射后7 d)上调, 随着EAE大鼠进入症状高峰期(注射后14 d), IL12水平亦达高峰, 恢复期(注射后21 d)IL12水平下降, EAE组在注射后7、 14和21 d血清中IL12水平分别为(11.407±0.208)ng/L、 (28.108±0.028)ng/L和(14.456±0.259)ng/L。EAE组3个时间点IL