TATBACEspGFP三融合基因慢病毒载体的构建与鉴定.doc

　　TATBACEspGFP三融合基因慢病毒载体的构建与鉴定 【关键词】 阿尔茨海默病；β分泌酶；穿膜肽；融合基因；慢病毒载体 　　ABSTRACT: Objective To construct the TATBACEspGFP triple fusion protein expressed from rebinant lentiviral vector. Methods The target fragment TATBACEsp, plified by PCR by means of asymmetrical primer/template, of CMV promoter of the lentiviral vector FUGiniprep Kit)、大量质粒DNA提取试剂盒(QIAGEN Plasmid Maxi kit C 25)、从琼脂糖凝胶回收DNA试剂盒(QIAquick Gel Extraction Kit)均购自Qiagen公司；限制性内切酶BamHⅠ、小牛肠碱性磷酸酶(phosphatase alkaline from calf intestine, CIAP)和TA克隆载体pMD18T Simple载体购自TaKaRa公司；慢病毒载体FUGD18T Simple载体构建pMD/TB，连接产物转化DH5α感受态细胞。 　　1.3.2 TATBACE基因和FUGiniprep Kit)制备并纯化pMD/TB质粒和FUGD/TB质粒和FUGD/TB载体的酶切鉴定 构建的pMD/TB载体经BamHⅠ单酶切，可获得与目的基因一致的清晰条带(100bp)，而空载质粒上只有2700bp的单一片段(图2)。 　　2.4 慢病毒表达载体的酶切鉴定 重组慢病毒载体pLV/TB的大小为10041bp，经限制内切酶BamHⅠ单酶切后，理论上产生9941bp及100bp两个片段。构建的基因表达载体pLV/TB经BamHⅠ单酶切，可获得与目的基因一致的清晰条带(100bp)，而空载质粒上只有9941bp的单一片段，结果显示，重组质粒大小、酶切片段大小和理论值一致 (图3)。 　　图1 重组慢病毒pLV/TB载体的构建（略） 　　Fig.1 The strategy for construction of the rebinant lentivector pLV/TB 　　图2 重组载体pMD/TB的酶切鉴定（略） 　　Fig.2 The identification of rebinant plasmid pMD/TB 　　M: DL2000 DNA marker; Lane 1: BamHⅠ/pMD/TB; Lane 2: pMD 18T simple; Lane 3: pMD/TB; Lane 4: TATBACEsp PCR 　　2.5 慢病毒表达载体的测序结果 将pMD/TB和pLV/TB中的目的片段进行测序，结果证实，重组序列与所设计的序列正向相符，无碱基缺失及错误。 　　3 讨论 　　将遗传物质转移到靶细胞中的方法有很多，以往的实验研究大多使用逆转录和腺病毒载体进行基因转染[1518]。逆转录病毒载体只能转导分裂期的细胞，而腺病毒载体所携带的目的基因不整合至靶细胞基因组，因他们各具有缺陷，在中枢神经系统基因 治疗 中运用受到限制。于人类免疫缺陷病毒1(HIV1)的慢病毒载体由于具有可以感染脑内非分裂期细胞的特性，并能实现目的基因的稳定表达，容纳外源性目的基因片段大，免疫反应小等特点使其成为中枢神经系统基因治疗的理想转移工具，越来越受到人们的重视[1922]。本研究选用复制缺陷型慢病毒(HIV1)作为载体是将HIV 3′端LTR中的U3部分切短，使之丧失启动病毒复制功能，同时插入CMV启动子的调控序列。HIV1 Tat蛋白转导结构域(PTD)具有细胞间扩散的特性，近来的研究表明TAT可以介导不同融合蛋白转导[57]。TAT融合蛋白可以在体内转导蛋白[89]。重要的是包括脑在内的不同组织间可以检测到TAT报告基因融合蛋白[9]。使TAT在疾病治疗的研究中具有重要的应用价值[10]。 　　本研究首次将TAT与慢病毒载体进行结合来携带目的基因，具有创新性。选用复制缺陷型慢病毒(HIV1)作为载体,将TAT与目的基因BACEsp进行融合，构建了TATBACEspGFP三融合基因慢病毒载体。利用慢病毒载体的特性在宿主细胞内实现TATBACEsp的稳定表达，并利用TAT具有细胞间扩散的特性，来实现目的基因表达产物BACE底物肽对β分泌酶的竞争性抑制作用，从而实现对AD的治疗作用。本研究中还采用新型报告基因GFP基因，将其与TATBACEsp基因融合表达。GFP