β分泌酶底物肽对阿尔茨海默病细胞模型的保护作用.doc

　　β分泌酶底物肽对阿尔茨海默病细胞模型的保护作用 【关键词】 阿尔茨海默病;β分泌酶底物肽;AD细胞模型 　　ABSTRACT:Objective To study the effect of βscretase substratebase peptide (BACEsp) on cellular model of Alzheimers disease (AD). Methods The cellular model of AD established a cell SKNSH induced by amyloid precursor protein (APP) munocytochemistry ent. Results Cell viability and APP expression in the cells that had been first infected by rebinant retrovirus pLXSNBACEsp odel of AD. 　　KEY 购自GIBCO公司;兔抗人APP抗体和SABC免疫组织化学试剂盒(即用型)购自武汉博士德生物公司;引物由北京奥科生物技术有限责任公司合成。LeicaDM16000B 型图象分析系统(德国);ELx800型酶标仪(美国)。 　　1.2 细胞培养及G418筛选 SKNSH细胞用含100mL/L FBS的DMEM[H]培养液，37℃、50mL/L CO2常规条件下培养，常规胰酶消化传代。以0～1100μg/mL共12个浓度梯度加入G418，以最低细胞全部死亡浓度为基准，定为SKNSH细胞的G418筛选浓度。 　　1.3 pBV感染的检测 本实验室在前期实验中成功得到了携带BACEsp基因的重组病毒pBV，以pBV感染过的SKNSH细胞基因组DNA为模板，以BACEsp基因扩增的上游引物(5′CGGAATTCGTTACCATGACAAATATCAAGACGGAGG 　　AGATCTCTGAAGTG3′)为引物，进行PCR反应。反应条件：94℃预变性5min，94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸60s，30个循环后，72℃延伸5min。反应产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。 　　1.4 AD细胞模型的建立 SKNSH细胞培养于经多聚赖氨酸处理的96孔板，37℃、50mL/L CO2常规条件下培养48h，待细胞密度约为90%时换液，加入经Lipofectamine 2000TM介导的APP转染液100μL/孔，培养96h，建立AD细胞模型。 　　1.5 实验分组 本实验共分5组：空白对照组、正常对照组、AD细胞模型组、pBV后处理组、pBV预处理组。前3组均以含100mL/L FBS的DMEM[H]培养，不经pBV作用，pBV后处理组以pBV感染AD模型细胞，pBV预处理组是用APP转染预先经pBV感染过的SKNSH细胞。 　　1.6 细胞活性检测 各组细胞以2×105/mL的密度种入经多聚赖氨酸处理的96孔板，常规培养48h后更换培养液，经相应处理96h后，加入MTT 20μL，37℃、50mL/L CO2条件下培养4h，弃上清;加入DMSO 150μL/孔，充分震荡10min，酶标仪于490nm波长测定A值。 　　1.7 免疫细胞化学检测 各组细胞以2×105/mL密度接种于经多聚赖氨酸处理的盖玻片上，在相应条件下培养48h，预冷PBS洗3次;40g/L多聚甲醛溶液固定，PBS洗3次;1mL/L TritonX100 15min，PBS洗3次;3mL/L H2O2 30min，PBS洗3次;入一抗(APP浓度1∶300)，4℃过夜，PBS洗3次;入鼠抗兔二抗，37℃孵育30min，PBS洗3次;SABC复合物，37℃ 30min，PBS洗3次;DAB显色5min，至棕色，蒸馏水洗2次，终止DAB反应;甘油封片，镜下观察，LeicaDM16000B 型图像分析系统进行数据分析。 　　1.8 统计学处理 所有数据均采用SPSS13.0软件包分析。实验结果以数据和图表的形式表示，测定值以均数±标准差(±s)表示，多组间均数比较用单因素方差分析，两组间比较采用Student t检验。Plt;0.01为差异有统计学意义。 　　2.3 各组细胞活性的比较 以正常对照组细胞的A值记为100%，AD模型组和pBV后处理组较正常对照组的细胞活性明显降低，差异有统计学意义(Plt;0.01);pBV预处理组与正常对照组的细胞活性相近，差异无统计学意义(Pgt;0.05)，与AD模型组相比细胞活性高，差异有统计学意义(Plt;0.01，表1)。 　　2.4 APP蛋白的表达情况 正常对照组中未见免疫反应染色阳性的细胞，AD模型组、