实时定量PCR分析小鼠树突状细胞TLR4 mRNA表达及地塞米松的调节.doc

　　实时定量PCR分析小鼠树突状细胞TLR4 mRNA表达及地塞米松的调节 ：张罕, 吕喆, 李冬妹, 何秀娟, 伍香玲, 胡永秀 【摘要】 　　目的: 建立检测小鼠Toll样受体4（TLR4）mRNA表达水平的SYBR GreenⅠ实时定量PCR实验; 观察小鼠骨髓源树突状细胞（DC）发育成熟过程中TLR4 mRNA表达水平的动态变化以及地塞米松（DEX）对DC TLR4 mRNA表达的影响。方法: （1）用细胞因子定向诱导的方法将小鼠骨髓细胞培养为DC; （2）构建pUCmT/TLR4和pUCmT/βactin重组质粒, 建立检测小鼠TLR4 mRNA水平的实时定量PCR实验; （3）用实时定量PCR技术对体外培养4、 6、 8、 10、 12 d的DC TLR4 mRNA表达水平进行动态观察; （4）在DC培养体系中加入DEX, 与常规培养DC TLR4 mRNA表达水平进行比较。结果: （1）从小鼠骨髓细胞中成功诱导培养了DC, 经免疫磁珠纯化后其纯度可达90%以上; （2）建立了能精确分析小鼠TLR4 mRNA表达水平的SYBR GreenⅠ实时定量PCR实验; （3）在DC培养前期TLR4 mRNA表达水平变化不大, 后期则明显升高; （4）DEX可使DC TLR4 mRNA表达增强。结论: 小鼠骨髓源DC TLR4 mRNA表达水平与其发育成熟阶段密切相关; DEX促进DC TLR4 mRNA表达。 【关键词】 实时定量PCR 树突状细胞 TLR4 地塞米松 　　[Abstract] AIM: To establish a SYBR GreenⅠ quantitative realtime PCR method for detecting the expression of the TLR4 mRNA of mice and to monitor the dynamics for TLR4 mRNA level of mice bone marroaturation and the effect of dexamethasone (DEX) on TLR4 expression. METHODS: (1) DC from mice bone marroagic beads. (2) The bined plasmid pUCmT/TLR4 and pUCmT/βactin for the standard materials in the realtime PCR ics for the express TLR4 mRNA of DC cultivated in vitro for 4, 6, 8, 10, 12 days RNA expression bete PCR method for analyzing the TLR4 mRNA expression level of the mice RNA level RNA and the period of maturation of DC and the expression of TLR4 could be increased by DEX. 　　[Keye PCR; dendritic cells; toll like receptor4; dexamethasone 　　Toll样受体（toll like receptors, TLR）是一类重要的模式识别受体（pattern recognition receptor, PRR）, 现已确认的人类TLR家族成员有11个（TLR1～TLR11）, 其中发现最早和功能相对比较清楚的是TLR4。TLR4主要存在于巨噬细胞、 中性粒细胞以及树突状细胞（dendritic cells, DC）表面, 可接受G-菌脂多糖（LPS）的刺激而活化, 进而通过一系胞内信号转导过程, 最终使转录因子NFκB活化, 启动多种与炎症反应相关的基因转录。近年, 对于TLR4与DC发育成熟的关系以及TLR4介导的信号转导通路的研究逐渐受到关注, 人们意识到DC的功能状态很可能与TLR4所介导的信号转导有密切联系, 机体由于多种原因使TLR4表达下降或者上升, 其结果均可影响DC的成熟状态, 从而影响机体的免疫状况[1]。地塞米松（dexamethasone, DEX）目前已证实该药能够在免疫应答的各个环节发挥抑制效应, 其中包括抑制DC的抗原提呈能力和DC的分化[2]。DEX能否通过阻断TLR4信号转导途径来影响DC的成熟,从而影响抗原的提呈？ 目前还没有定论。SYBR GreenⅠ realtime PCR是PCR定量技术中的一种, 可以对基因扩增的起始模板的拷贝数进行精确定量, 还可以通过熔解曲