应用抑制性消减杂交技术筛选NS5ABP37的反式调节基因.doc

　　应用抑制性消减杂交技术筛选NS5ABP37的反式调节基因 ：张雷，马清涌，孟宪魁，李康，成军 【摘要】 目的 应用抑制性消减杂交(SSH)技术构建NS5ABP37反式激活相关基因差异表达的cDNA文库，筛选NS5ABP37蛋白反式激活相关基因。方法 以表达质粒pcDNA3.1(-)NS5ABP37转染HepG2细胞，以空载体pcDNA3.1(-)为对照,从转染后的细胞裂解液中提取mRNA并合成cDNA，经RsaⅠ酶切消化后将实验组cDNA分成两组，分别衔接两种不同接头，再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR反应;第2次PCR产物与pGEMT easy克隆载体连接，构建cDNA消减文库，并转化大肠杆菌进行文库扩增，随机挑选克隆经PCR鉴定后进行测序及同源性分析。结果 成功构建了人NS5ABP37蛋白反式激活相关基因差异表达的cDNA文库。扩增后得到60个200～1000bp插入片段的克隆，随机挑选其中20个测序，并通过生物信息学分析获得其全长基因序列，结果共获得9种已知功能编码基因。结论 NS5ABP37基因功能涉及细胞生长调节、信号转导和能量代谢。 【关键词】 抑制性消减杂交;NS5ABP37;丙型肝炎病毒;cDNA文库 ABSTRACT: Objective To screen and identify human genes transactivated by NS5ABP37 by constructing a cDNA subtractive library atics techniques pty vector transfected HepG2 cells, the mRNA the cells. SSH method ployed to analyze the differentially expressed DNA sequence in the te RsaⅠ digestion, smallsized cDNAs es of nested PCR, the second PCR production id vectors to set up the subtractive library. Amplification of the library plified library contained 60 positive clones ed in 20 clones randomly, and the fulllength sequences atics method. Altogether 9 coding sequences ay be involved in cell groetabolism. 　　KEY ix、Advantage PCR Cloning试剂盒(Clontech);Lipofectamine 2000转染试剂(Invitrogen);T、IPTG、XβGal、T7和SP6通用引物及pGEMTeasy载体(Promega);Taq酶(鼎国);EcoRⅤ、HindⅢ、NheⅠ(TaKaRa);玻璃奶回收试剂盒(博大泰克)。DNA测序由上海生工公司完成。 　　1.2 方法 　　1.2.1 真核表达载体的构建 根据NS5ABP37基因序列设计特异引物(P1 5′GATATCATGACGGAGCCCGAAGACGTA3′和P2 5′AAGCTTTT 　　ACTTCATTAAGAAGTACTG3′)并进行PCR扩增，将扩增产物与pGEMT载体连接，转化大肠杆菌后行酶切鉴定并测序。将鉴定正确的目的基因与pcDNA3.1(-)真核表达载体连接，再次转化大肠杆菌并用碱裂解法提取质粒后进行EcoRⅤ/HindⅢ酶切分析，鉴定正确后用A，经琼脂糖凝胶电泳及紫外分光光度计进行定性、定量分析。 　　1.2.3 消减杂交文库的建立 采用PCRSelect cDNA Subtraction试剂盒，按SSH方法说明书进行。以转染重组质粒和空载体的HepG2细胞的mRNA为模板逆转录合成cDNA(dscDNA)，并分别标记为实验组(tester)和驱动组(driver)，经RsaⅠ(一种识别4碱基序列的酶)消化的dscDNA形成平头末端片段。把实验组cDNA均分为两份，分别与试剂盒提供的特殊设计的寡核苷酸接头1和2R连接，然后与过量驱动组cDNA杂交;合并两种杂交产物后再继续与变性的驱动组cDNA进行第2次杂交;经巢式PCR扩增消减杂交的cDNA，使实验组cDNA中特异性表达或高表达的片段得到特异性扩增。 　　1.2.4 消减杂交文库的扩增和克隆分析 用High Pure PCR Product Purification试剂盒纯化2次PCR扩增后的产物，并