慢性粒细胞白血病细胞eIF4E mRNA表达及影响因素.doc

　　慢性粒细胞白血病细胞eIF4E mRNA表达及影响因素 【摘要】 目的： 初步探索真核细胞翻译起始因子4E(eIF4E)在慢性粒细胞白血病（CML）不同病程，包括慢性期（CP）、加速期(AP)、急变期(BC)、急变治疗后(BCR)骨髓细胞中mRNA表达及其在K562细胞中的表达影响因素. 方法： RTPCR检测25例骨髓样本［CML急变期（CMLBC）10例，慢性期(CMLCP)8例，加速期（CMLAP）1例，急变期治疗后（CMLBCR）3例，贫血对照3例］eIF4E mRNA表达，及其中9例CML eIF4E和RNA结合蛋白K（hnRNP K）mRNA表达，并分析两种基因表达相关性. 用酪氨酸激酶抑制剂STI571处理K562细胞，并用hnRNP K 短发夹RNA(shRNA)逆转录病毒载体感染K562细胞，经G418稳定筛选，分别检测eIF4E mRNA表达变化. 结果： 与贫血对照组相比，CMLBC和CMLBCR eIF4E mRNA表达差异有统计学意义（Plt;0.05），而与CMLCP无统计学意义，hnRNP K与eIF4E mRNA表达呈线性相关（r=0.79, Plt;0.01）.STI571能轻微下调 K562细胞eIF4E mRNA表达.hnRNP K干扰组hnRNP K和eIF4E mRNA表达比空载对照组分别下降55.22％，55.27%. 结论： CML急变期eIF4E mRNA表达显著增高，BCR/ABL融合蛋白可能参与调节eIF4E mRNA表达但效应有限，hnRNP K分子在eIF4E mRNA表达调控中可能发挥一定作用. 【关键词】 白血病，髓样，慢性；真核细胞起始因子4E；STI571；核糖核蛋白K，核不均一 0引言 慢性粒细胞白血病（Chronic Myelogenous Leukemia，CML）是源于造血干细胞异常的恶性克隆性增殖性疾病，具有特征性的ph染色体和bcr/abl融合基因，所编码的BCR/ABL融合蛋白具有异常的酪氨酸激酶活性，是CML发生和发展的主要因素，在CML从慢性期(CMLCP)向急变期(CMLBC)转化过程中起关键作用，然而急变的具体机制仍不清楚.研究报道，真核细胞翻译起始因子4E(Eukaryotic translation initiation factor4E，eIF4E)在很多的人类肿瘤中过表达，可促进肿瘤增殖［1］，抑制凋亡［2］，阻滞分化［1,3-4］.研究［5］发现，mRNA帽结合复合物（eIF4F）是CML急变时一个重要治疗靶标，而eIF4E是该复合物重要的组成部分.已知RNA结合蛋白K(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K，hnRNP K)在CML急变细胞中高表达［6］，而hnRNP K蛋白在Hela细胞中通过转录水平升高eIF4E表达而诱导恶性表型发生［7］.我们选择eIF4E为切入点，采用RTPCR技术在CML细胞中检测eIF4E mRNA表达，并进一步探讨其与BCR/ABL融合蛋白及其下游分子hnRNP K之间的关系，旨在为CML急变提供新的分子治疗靶点. 1材料和方法 1.1材料采集2006/2007年间重庆医科大学附属第一、二医院血液科诊断为CML的患者骨髓标本22例，其中,CMLCP 8例，加速期(CMLAP)1例， CMLBC 10例，急变治疗后有所缓解(CMLBCR)3例，以及贫血对照骨髓3例.MMLV逆转录试剂盒，限制性内切酶EcorⅠ，HindⅢ，DNA Marker等（TaKaRa公司）；质粒抽提试剂盒（Qiagen公司）；TransfastTM转染试剂（Promega公司）；G418（Invitrogen公司）；酪氨酸激酶抑制剂STI571获赠于诺华制药公司.DH5α菌株和K562细胞株和PT67细胞由本室储存.pSUPER retro hnRNP K shRNA(含有5′tggtgaatttggtaaacgc3′)和pSUPER retro neo+gfp逆转录病毒载体获赠于Danilo Perrotti教授［6］.根据人eIF4E mRNA序列(NM_001968)以及hnRNP K mRNA序列（NM_002140，NM_031262，NM_031263），利用Primer Premier 5.0软件自行设计PCR引物，由上海生物工程技术有限公司合成.eIF4E引物,P1：5′ACGGAATCTAATCAGGAGGT3′，P2：5′TTCCCACATAGGCTCAATAC3′，产物长度：246 bp.hnRNP K引物，P1：5′CCCGATAGGGTTGTAGAGTG3′，P2：5′ATTG