抗PLA2G13多克隆和单克隆抗体的制备与鉴定.doc

　　抗PLA2G13多克隆和单克隆抗体的制备与鉴定 ：李淑珍, 刘莹, 陈苗, 柳晓兰, 唐小波, 高建恩, 朱大岭, 孙启鸿 【摘要】 　　目的: 制备分泌型的磷脂酶A2 G13（group XIII secreted phospholipase A2, PLA2G13）的多克隆抗体（pAb）和单克隆抗体（mAb）, 并对抗体进行特性鉴定。方法: 以人正常肝cDNA文库为模板, 构建重组表达质粒pGEX-4T-1-PLA2G13（即PLA2G13-GST）和pET-32a-PLA2G13（即PLA2G13-His）。PLA2G13-GST融合蛋白作为免疫原制备兔pAb和鼠mAb。采用r）约19700的蛋白, 与 文献 报道中PLA2G13的实际Mr相符。通过筛选共获得8株可稳定分泌抗PLA2G13的杂交瘤细胞株, r）约21400, 主要存在于细胞外基质, 成熟型PLA2G13 Mr约19700, 其结构特征类似于磷脂酶家族另一个成员PLA2G12, 但二者的组织分布呈现很大差别［1］。RNA blots结果展示PLA2G13基因在成人肝脏, 小肠中表达, 而在肾脏中则呈现较低水平的表达。生理条件下, 分泌型磷脂酶家族参与炎症反应、 宿主防御反应和动脉粥样硬化等生物学过程。其家族成员多具有磷脂酶活性, 而PLA2G13在其活性位点由亮氨酸突变为组氨酸, 因此不具有磷脂酶活性。近年来的基因水平研究和蛋白芯片研究结果均显示PLA2G13在肝癌和肝硬化发生时基因和蛋白水平上调［2］。但是目前, PLA2G13基因在肝癌发生 发展 中的确切分子机制仍然不清楚。我们主要从构建重组表达载体入手, 获得其融合表达蛋白后, 免疫新西兰雄性大耳白兔和 BALB/c小鼠, 制备抗PLA2G13的多克隆抗体（pAb）和单克隆抗体（mAb）, 并对抗体进行特性鉴定, 为进一步研究PLA2G13的功能及其在肝癌的发生, 发展及 治疗 中的作用。 　　 1 材料和方法 　　1.1 材料 成人肝cDNA文库购自Cloech公司。大肠杆菌BL21感受态菌株为本实验室自制。pGEX-4T-1和pET-32a为Amersham公司产品。限制性内切酶EcoR I和Xho I、 ExTaq酶、 T4连接酶等购自TaKaRa公司。PCR回收试剂盒, 质粒提取试剂盒购自Omega Biotek公司。BALB/c小鼠和新西兰雄性大耳白兔购自军事医学 科学 院动物中心。小鼠骨髓瘤细胞株Sp2/0为军事医学科学院放射与辐射医学研究所免疫室制备。Hbt小鼠mAb分型试剂盒购自HyCult biotechnology b.v. 公司。鼠抗GST标签mAb、 HRP-羊抗鼠IgG、 HRP-羊抗兔 IgG、 ECL显色系统均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。 　　1.2 方法 　　1.2.1 PLA2G13抗原的制备和纯化 根据Human Protein Reference Database中提供的PLA2G13的氨基酸序列, 并结合应用生物信息学软件DNAstar的表位分析, 综合设计引物。在其上游引物设计EcoR I酶切位点, 下游引物设计Xho I酶切位点, 片段全长297个碱基, 以人正常肝cDNA文库为模板进行PCR反应。回收扩增目的片段, 并将目的片段及pGEX-4T-1和pET-32a载体分别经EcoR I和Xho I双酶切并连接, 转化入大肠杆菌, 阳性克隆经测序正确后抽提质粒, 进行诱导表达。PLA2G13在BL21细菌中以包涵体形式表达, 收集蛋白并进行纯化。 　　1.2.2 PLA2G13-GST和PLA2G13-His融合蛋白的B显色。(2)r分别为38000和32000, 与预测的PLA2G13融合蛋白的Mr相一致, 表达量约占菌体总蛋白的50%～60%, 融合蛋白主要以包涵体的形式表达（图1）。通过Western blot检测, 应用抗GST和抗His的抗体能够在相应位置分别检测到PLA2G13-GST和PLA2G13-His融合蛋白（图2）。 　　图1 PLA2G13融合蛋白的SDS凝胶电泳分析（略） 　　1: 阴性对照（大肠杆菌BL21裂解蛋白）; 2: 大肠杆菌BL21中表达的PLA2G13-His融合蛋白; 3: 大肠杆菌BL21中表达的PLA2G13-GST融合蛋白. 　　图2 PLA2G13-GST和PLA2G13-His融合蛋白的r约38000和32000处各有一特异性的条带, 说明此pAb可以特异性识别重组PLA2G13蛋白。r为19700蛋白, 这与 文献 报道的PLA2G13的Mr一致, 在Mr为62000~64000处也有一清晰条带, 于其无活性形式蛋白Mr相符。阴性对照（兔免疫前血清代替一抗）在相应位置无条带（图3）。