新鲜人羊膜负载构建兔角膜上皮.doc

　　新鲜人羊膜负载构建兔角膜上皮 【摘要】 目的 新鲜人羊膜负载构建兔角膜上皮，为全角膜组织工程作基础。方法 采用组织块法培养兔角膜缘干细胞，以新鲜人羊膜为载体，形成单层细胞膜片后用于传代；采用相差显微镜进行形态观察及AE5、p63免疫荧光鉴定。结果 培养24 h，兔角膜缘组织块边缘可见有细胞长出，之后形成“沙滩样”移形带，培养至7～8 d细胞在羊膜上形成单层膜状，细胞透明，边缘整齐，形态呈多样化，以卵圆形和多边形为主；AE5抗体、p63抗体染色阳性细胞比例分别为（41.72±11.35）%、（21.57±6.36）%；2代AE5和p63阳性细胞比例与原代比较，无显著性差异（P﹥0.05）；3代AE5和p63阳性细胞比例与原代比较，差异有统计学意义（P﹤0.05）；但4代AE5阳性细胞比例又明显升高。结论 以新鲜羊膜为载体、采用组织块法培养角膜缘干细胞可获得较好的角膜上皮片，在传代细胞中，3代细胞分化程度最低、增殖能力最强，最适合移植。 【关键词】 角膜缘干细胞；新鲜羊膜；细胞培养 【Abstract】 Objective To produce rabbit corneal epithelium bal stem cell on human fresh amnion.Methods Rabbit limbal epithelium an fresh amnion by tissue block method. It e ary cells formed monolayer cell patch. Keratin 3(AE5) and p63 ary and four generation cells munofluorescence. Contrast phase microscope the limbal tissue block ed, and confluent monolayer cell patch appeared ary cells. Positive percentages of AE5 and p63 ary cells (P﹥0.05), ary cells(P﹤0.05), and AE5 positive cells increased in the fourth generation.Conclusion Corneal epithelium is produced bal stem cell by method of tissue block on human fresh amnion. Among all generations, the third generation cells are most suitable to be translated, because of the lobal stem cells，fresh amnion，cell culture 组织工程构建角膜上皮是组织工程化全角膜的课题之一。角膜缘干细胞是角膜上皮细胞增殖、分化和移行的，目前这一观点已经得到公认。种子细胞问题解决后，载体的选择已成为研究重点。本课题组采用新鲜羊膜负载培养角膜缘干细胞，为角膜上皮组织工程的载体选择提供参考。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 组织：兔眼取自健康纯系新西兰大白兔，雌雄不限，体质量2～2.5 kg，由重庆医科大学动物中心提供，在实验前用0.25％氯霉素滴眼液点眼，4次/日，共3 d。羊膜取自排除肝炎病毒、AIDS病毒及梅毒等传染病的剖腹产妇的胎盘。 1.1.2 主要试剂：DMEM/F12培养液、胎牛血清（美国Hyclone公司），鼠抗兔单克隆AE5抗体（K3抗体）、鼠抗兔单克隆抗体p63（英国Abcam公司），免疫荧光染色试剂盒（Sigma公司），硝酸纤维素膜（北京鼎国生物制品公司），青霉素、链霉素、庆大霉素（上海生物工程技术服务有限公司）。 1.1.3 主要仪器：相差显微镜(Likon UFXⅡ型，OLYMPUS日本)，CO2培养箱(2300型SHELDON美国)，眼科显微手术器材等。 1.2 方法 1.2.1 新鲜羊膜的制备：①羊膜取材：含抗生素（4 000 U/ml的庆大霉素、青霉素500 U/ml、链霉素500 μg/ml）PBS洗去胎盘的血凝块，钝性剥离羊膜，使其与绒毛膜分离，同时用含抗生素的PBS冲洗干净后浸泡20 min，上皮面朝上平铺于硝酸纤维素膜上。将上述附有羊膜的纸片修剪成2.5 cm×2.5 cm的小块。PBS冲洗2次，置于细胞培养板中DMEM/F12培养液（含100 U/ml青霉素、100 μg/ml链霉素，无血清）浸泡备用，所制羊膜均于取材后12 h内使用。②羊膜去上皮：含0.25%胰蛋白酶和0.01%