真核表达质粒pIRES2eGFPAnnexin A2的构建及其在293T细胞中的表达.doc

　　真核表达质粒pIRES2eGFPAnnexin A2的构建及其在293T细胞中的表达 ：李娜, 周红 俞颖, 王婷 黄宏亮, 石文霞 王海波 【摘要】 目的： 构建含有人Annexin A2基因的真核表达质粒pIRES2eGFPAnnexin A2，并在真核细胞293T中表达。 方法： 将质粒pCMV5Annexin A2上Annexin A2基因酶切后与真核表达质粒pIRES2eGFP连接，酶切鉴定及测序正确后，脂质体介导法转染293T细胞，荧光定量PCR及蛋白质印迹法检测其基因和蛋白的表达。 结果： 构建的质粒pIRES2eGFPAnnexin A2转染293T细胞后，目的基因mRNA和蛋白表达均明显增高。 结论： 成功构建pIRES2eGFPAnnexin A2质粒并表达蛋白，为研究Annexin A2的生物学功能奠定了基础。 【关键词】 Annexin A2； 真核表达； 抗磷脂综合征 ［Abstract］ Objective: To construct pIRES2eGFPAnnexin A2 eukaryotic expression vector carrying human Annexin A2 gene and express Annexin A2 protein in 293T cell.Methods： Annexin A2 gene digested from pCMV5Annexin A2 id pIRES2eGFPAnnexin A2 ediation of liposome.The expression of Annexin A2 e PCR. Results： The expression of Annexin A2 at both mRNA and protein levels e Annexins是一类钙依赖的膜磷脂结合蛋白，脊椎动物细胞的Annexins被命名为Annexin A 家族。其中Annexin A2由339个氨基酸组成，分子量36 kDa，主要表达于人单核细胞、内皮细胞和一些肿瘤细胞中，在细胞的膜形成、膜聚合、胞吞和胞吐中发挥功能。细胞膜上Annexin A2可作为多种蛋白的受体，在感染发生、肿瘤迁移、血凝和纤溶过程中起着重要作用。研究表明，它可作为纤溶酶原及组织纤溶酶原激活物的共同受体，介导纤溶酶的生成，有利于纤维蛋白的降解，维持纤溶的内稳态［1-3］。最近的研究发现，Annexin A2异源四聚体可介导纤溶酶与单核细胞结合，传递下游信号，引起趋化作用和炎性介质释放，与慢性炎症的发生 发展 有关［4］。 本小组的研究提示［5］，Annexin A2在抗磷脂抗体引发的血栓形成中起着重要作用，它可能作为抗磷脂抗体与磷脂结合蛋白复合物的受体，介导下游信号，引起血栓形成。本实验旨在构建真核表达质粒pIRES2eGFPAnnexin A2，并在293T细胞中表达目的蛋白，为进一步研究Annexin A2在抗磷脂综合征中的作用奠定基础。 1 材料与方法 1.1 材 料 DMEM及optiMEM培养基购于美国Gibco公司。胎牛血清购于兰州民海生物工程有限公司。逆转录试剂盒购于日本Toyobo公司。rTaq DNA聚合酶、dNTP、限制性核酸内切酶、DL2000,Sybergreen,1 kb DNA分子质量标准参照物均购于日本Takara Biotec公司。质粒抽提试剂盒购于美国Axygen公司。Trizol及LipofectamineTM2000购于美国Invotrigen公司。单克隆鼠抗人Annexin A2抗体购于美国Diagnostica公司。生物素化的兔抗鼠IgG购于美国Sigma公司。ECL显色试剂购于Santa Cruz（Europe）公司。真核表达载体pIRES2eGFP，293T细胞由本室保存。质粒pCMV5Annexin A2由美国McCrae K教授惠赠。 1.2 方 法 1.2.1 pIRES2eGFPAnnexin A2载体构建 将含Annexin A2基因的真核表达质粒pCMV5Annexin A2及载体pIRES2eGFP分别用Sal Ⅰ，bgl Ⅱ 双酶切（37 ℃，2 h），酶切产物10%琼脂糖凝胶电泳后，紫外灯下切胶回收。回收后的目的基因Annexin A2和载体pIRES2eGFP以摩尔浓度3∶1的比例混合，T4DNA连接酶16 ℃过夜进行黏性末端定向连接。次日将5 μl连接产物用热休克法转化感受态E.coli DH5a菌。转化产物涂于LB平板（含100 g/ml卡那霉素），待液体吸收后，37 ℃培养过夜。挑取单个菌落至3 ml LB培养基（含100 g/ml卡那