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HPLC方法测胆汁酸含量方法汇总反相高效液相色谱法测定鼠胆汁中游离与结合型胆汁酸试验仪器Ardent LC-1100高效液相色谱仪，附荧光检测器(A gilent公司，美国);Waters Nova C18色谱柱( 3.9 X 150 mm, 5l.μm) ( Waters公司美国)，保护柱及C18柱芯(Phenomenmex公司美国)；Chromabond C18固相萃取小柱(M acherey- Nagel)公司德国)。试验试剂4-嗅甲基-7-甲氧香豆素(BM C)、18-冠醚-6(DCC)，α-鼠胆酸(α-MCA) ,β-鼠胆酸(β-M CA)、熊脱氧胆酸(U DCA)、胆酸(CA)、猪脱氧胆酸(H DCA )、脱氧胆酸(DCA)、鹅脱氧胆酸(CDCA)、甘氨胆酸(GCA)、甘氨鹅脱氧胆酸(GCDCA)标准品及胆酞甘氨酸水解酶均购自美国sig m a公司。甲醇、乙睛(色谱纯，美国天地公司)，月桂酸(分析纯，上海化学试剂公司)，氢氧化钾、磷酸二氢钾(分析纯，成都化学试剂厂).色谱条件流动相:A相，甲醇:乙睛为1:2(V/V)；B相，超纯水；梯度洗脱程序:65%A (0~8min)，80% A(8~16 min)，90% A(16~20 min)；柱温：20℃；流速:1 mL/ min;激发波长:330nm；发射波长：400nm。样品处理样品预处理:取鼠胆汁20μL，加入120μmol/ L月桂酸甲醇液50μL，再加入乙睛2 mL，充分混匀，超声20 min, 10 000 g离心10 min，取上清液，在60℃氮气下吹干。胆汁酸的提取:测定游离与甘氨结合型胆汁酸时，将预处理吹干后的胆汁样品溶于2 mL 0.5mol/L磷酸盐缓冲液(pH 7)，加至已活化的固相萃取C18小柱上(用2 mL甲醇和5 mL蒸馏水依次活化C18小柱)，再用10 mL蒸馏水淋洗小柱，最后用3mL甲醇洗脱胆汁酸.测定牛磺结合型胆汁酸时，向预处理吹干后的胆汁样品中加入1 mg胆酞甘氨酸水解酶，再加入0. 025 mol/ L的磷酸钾缓冲液(pH 5.6) 0.5 mL,避光37℃反应30 min，再加入O.5mol/ L磷酸盐缓冲液(pH 7) 2 mL终止反应.然后加至已活化的固相萃取C18小柱上，其余步骤同测定游离与甘氨结合型胆汁酸.胆汁酸的衍生与测定:向胆汁酸洗脱液中加入150 μL 1. 8 mmol/ L KOH甲醇液于60 ℃氮气下吹干，然后加入10 mmol/ L BM C乙睛液与5 mmol/ LDCC乙睛液各50μL，密闭，37℃条件下反应30min，取10μL进样分析.高效液相色谱滓联质谱法同时测定血清中游离和结合型胆酸试验仪器 AP I 2000质谱仪(加拿大A ppliedBiosystens公司)，配备Perk in E Inmer 200泵和tubro离子源;A tlantisdC18色谱柱，150 mm X 3.9 mm, 5μm(美国Waters公司)，保护柱及C18柱芯(美国Phenanenex公司)，Chrcmabond C18ec ( 3 mL /200 m g德国M achere-N agel公司)，M illpore纯水装置(美国M illpore公司)。15种胆汁酸标准品和醋酸按均为色谱纯(Sigma公司);甲醇、乙睛和甲酸均为色谱纯(美国Tedia公司)。试验试剂15种胆汁酸标准品和醋酸按均为色谱纯(Sigma公司);甲醇、乙睛和甲酸均为色谱纯(美国Tedia公司)。色谱条件柱温:25℃；流速:1 m L /min分流比为1:4；流动相A: 5 mm o 1/L醋酸铵和0.O1%甲酸水溶液；B: 5 mm o 1/L醋酸铵和0 O1%甲酸甲醇溶液。梯度洗脱程序为:Omin（80% B)9min(97.0% B)10 m in ( 80% B)15 m in ( 80 % B )。样品处理蛋白沉淀法：800 μL乙睛中加入300 μL血清，混匀1 min,超声30min以15000 X g离心15min,取900μL上清液60℃氮气吹干，其余同固相萃取。固相萃取法：依次用1 mL甲醇,1mL0.05%甲酸溶液活化固相萃取小柱。1 mL 0.05%甲酸溶液中加入300μL血清，混匀1 min后上小柱。依次用1 m L 0.05%甲酸溶液、1 mL甲醇水溶液( 45: 55, V /V)冲洗。在重力作用下滴干后，真空抽干。再用L 5 mL甲醇洗脱，洗脱液在600C氮气吹干，残余物溶于100 μL流动相(A: B= 20: 80，V/V)中，漩涡混匀lmin超声2min。取20 μL进行H PLC-MSIMS分析，检测时间15min。高效液相色谱法同时测定胆汁中9种结合型胆汁酸试验仪器Shimadzu