HIP-55复合体增强HIP-55蛋白稳定性.pdfVIP

北 京 大 学 学 报 ( 医 学 版 ) JOURNALOFPEKINGUNIVERSITY(HEALTHSCIENCES) Vo1．47 No．6 Dec．2015 ·893 · · 论 著 · 14．3．3／HIP．55复合体增强 HIP-55蛋白稳定性 田爱炬，李子健 (北京大学第三医院心内科血管医学研究所，卫生部心血管分子生物学与调节肽重点实验室 ，分子心血管学教育 部重点实验室 ，心血管受体研究北京市重点实验室，北京 100191) [摘 要]目的：用双分子荧光互补及免疫共沉淀技术验证HIP一55与 14—3—3在HEK293细胞中存在相互作用 ，并进 一 步研究其生物学意义。方 法：利用 GATEWAY系统构建 PDEST—N—Venus—HIP一55WT(野生型)，PDEST—N—Venus— HIP一55AA(突变体 S269A／T291A)，PDEST—GST—HIP一55WT及 PDEST—C—Venus一14—3—3T重组质粒 ，利用双分子荧光互 补及免疫共沉淀技术检测两者的相互作用 ，同时应用 14—3—3蛋白相互作用抑制肽R18和HIP-55蛋白突变体 (HIP- 55AA突变体S269A／T291A不能与 14—3—3相互作用)作为工具研究两者结合后对嘌呤霉素诱导的HIP-55蛋白表达 的影响。结果：外源转入的Venus—HIP一55WT、Venus—HIP-55AA及Venus一14—3—3蛋白能够在 HEK293细胞中表达；双 分子荧光互补实验结果表明HIP一55与 14—3-3存在相互作用 ，HIP一55蛋白的$269／T291位点介导 HIP-55与 14—3—3 的相互作用 ；免疫共沉淀技术表明内源性HIP一55与 14—3—3存在相互作用 ；进一步研究发现HIP一55与 14—3—3复合体 增强 HIP一55蛋白的稳定性 ，保护 HIP-55不被降解。结论：14—3—3与HIP-55存在相互作用 ，14—3—3／HIP一55复合体可 以促进 HIP-55蛋 白的稳定性。 [关键词]HIP一55蛋白，人 ；14—3—3蛋白质类；蛋白质相互作用 [中图分类号]R34 [文献标志码]A [文章编号]1671—167X(2015)06-0893-05 doi：10．3969／j．issn．1671—167X．2015．06．001 14．3_3／HIP_55complexincreasesthestabilityOfHIP．55 TIANAi-ju，LIZi-jian (InstituteofVascularMedicine，PekingUniversityThirdHospital，KeyLaboratoryofCardiovascularMolecularBiologyand RegulatoryPeptides，MinistryofHealth，KeyLaboratory ofMolecularCardiovascularSciences，Ministry ofEducationand BeijingKeyLaboratoryofCardiovascularReceptorsResearch；Beijing100191，China) ABSTRACT 0biective：Tofurtherdemonstratetheinteractionofanew 14．3．3interactionproteinhema． topoieticprogenitorkinase1lHPK11．interactingprotein(HIP．55)and14—3．3proteinsanditspotential biologicalfunctioninHEK293cells．Methods：PDEST—N—Venus．HIP．55WT (wildtype)．PDEST．N．Ve． nus—HIP-55AA (mutants，$269A／T29lA，abolishingthebindingofHIP-55to14—3—3)．PDEST．CST． HIP一55WTandPDEST—C—Venus一14—3—3Tplasmidswereconstructedbygatewaysystem．Theirexpressions weredemonstrated