RNA干扰HOXA7联合甲氨蝶呤对U937细胞增殖、凋亡的影响.pdfVIP

医学杂 志2013年第 29卷第 20 3285 RNA干扰 HOXA7联合 甲氨蝶呤对 U937细胞增殖、 凋亡 的影响 贾秀红 y-宝慧 李建厂 摘要 目的：研究RNA干扰 (RNAinterference，RNAi)抑制 HOXA7表达联合 甲氨蝶呤 (methotrexate， MTX)对白血病U937细胞增殖、凋亡的影响。方法：将靶向HOXA7特异性表达栽体 (pGPU6／GFP／Neo— shHOXA7)转染U937细胞。RT—PCR和Westernblot法鉴定其对 HOXA7表达的抑制作用。实验分 5组 ：空白 对照组、阴性对照组、RNAi组、MTX组、RNAi+MTX组，MTY法和流式细胞术分别检测各组细胞增殖抑制和凋亡 情况 结果：RNAi组HOXA7在mRNA和蛋白水平相对表达量分别为(23．910±1．662)％、(23．980±1．651)％， 均显著低于对照组 (尸0．05)；RNAi+MTX组细胞增殖抑制率明显高于RNAi组和MTX组 (P0．05)；RNAi+ MTx组细胞凋亡率为 (32．941±2．565)％，明显高于RNAi组和 MTx组 (P0．05)。结论：RNAi抑制 HOXA7 表达能增强MTX对U937细胞增殖抑制、凋亡诱导作用，RNAi抑制HOXA7联合MTX有望成为白血病治 疗的新方法。 关键词 基 因，同源盒 ： 甲氨蝶呤： U937细胞 目前 白血病多采用化疗为主 的综合治疗 。 CO培养箱中培养，2～3d传代 1次，取对数生长 RNA干扰 (RNAinterference，RNAi)抑制 白血病相 期细胞进行后续实验。 关基因表达具有高效 、无毒等特性…，因此 RNAi 1．2．2 U937细胞转染及筛选 将 U937细胞接种 联合化疗将成为 白血病基因治疗的重要切人点。 于6孔板上。优化转染条件，将前期实验构建的靶 HOXA7是HOX基因家族中重要一员 ．在造血系统 向 HOXA7特异性表达载体 (pGPu6／GFP／Neo． 发育过程起重要调控作用 ，而 HOXA7过表达与 shHOXA7)和阴性对照质粒载体 (pGPU6／GFP／ 白血病发生、发展密切相关 2_，因此研究 RNAi抑 Neo．shNC)分别转染 U937细胞，转染48h后 ．加 制 HOXA7表达联合化疗有望为白血病治疗提供 G418(800~g／mL)进行阳性克隆筛选。得到稳定表 新思路。 达 pGPu6／GFP／NeoshHOXA7的U937细胞 (命名 1 材料与方法 为 shHOXA7．U937细胞)和稳定表达 pGPU6／GFP／ 1．1 材料 白血病细胞株 U937 (滨州医学院提 Neo．shNC的U937细胞(命名为shNC．U937细胞)。 供)，RPMI1640培养基、胎牛血清 (美国Hyclone公 1．2．3 RT．PCR鉴定稳定转染重组质粒 的 U937 司)；X．tremeGENEHPDNA转染试剂(Roche公司)： 细胞 分别收集 shHOXA7．U937(实验组)、shNC— 反转录、PCR试剂盒 (日本 TAKARA公司)；MTT细 U937(阴性对照组)和U937(空 白对照组)细胞 ．提 胞增殖检测试剂盒 (碧云天生物有限公司)：细胞 取RNA，两步法进行 RT．PCR。所用引物序列如下： 凋亡检测试剂盒 (凯基生物公司)；兔抗人 HOXA7 HOXA7正义链 5-ACCGACACTGAAAGCTGCCG．3．． 多克隆抗体 (博士德生物有限公司)；HOXA7和内 反义链 5一AGGTCCTGAAGACCGCATCC．3．扩增 参 p—actin引物 (上海赛百盛生物技术有限公司)： 长度为 410bp。B．actin正义链 5一CTCCATCCTGG 注射用 甲氨蝶呤