转化生长因子β1基因RNAi质粒载体的构建与鉴定.docVIP

　　转化生长因子β1基因RNAi质粒载体的构建与鉴定 ：王翔，胡治平，周为军，汤建光，卢 伟，唐湘祁 【摘要】 目的 构建人转化生长因子β1(TGFβ1)基因RNAi质粒载体。方法 根据人TGFβ1 mRNA序列选择3个靶序列并设计合成相应3对寡核苷酸序列，同时合成1对阴性对照寡核苷酸序列；将以上4对寡核苷酸序列退火后连入pRNAU6.2/Lenti质粒并分别命名为pRNAU6.2/Lenti1、pRNAU6.2/Lenti2、pRNAU6.2/Lenti3、pRNAU6.2/Lenti4。酶切和测序鉴定后，将以上重组质粒转染Hela细胞，运用RTPCR和ELISA检测TGFβ1 mRNA和蛋白的表达水平。结果 酶切和测序证实目的寡核苷酸片段已被准确克隆到pRNAU6.2/Lenti质粒；与对照组相比，pRNAU6.2/Lenti1、pRNAU6.2/Lenti2转染Hela细胞后，TGFβ1 mRNA水平及蛋白水平的表达量均受到明显抑制；其中TGFβ1蛋白水平在pRNAU6.2/Lenti1组下降79.2%，在pRNAU6.2/Lenti2组下降53.7%，统计有显著性差异(Plt;0.01)。结论 成功构建了人TGFβ1基因RNAi质粒载体，对于TGFβ1高表达疾病的基因 治疗 奠定了基础。 【关键词】 RNAi；转化生长因子β1；质粒载体 ABSTRACT: Objective To construct a plasmid vector of RNA interference (RNAi) of transforming groRNA sequence firstly, then three pairs of oligonucleotide sequences and one pair of negative control oligonucleotide sequence ents id, ed pRNAU6.2/Lenti1, pRNAU6.2/Lenti2, pRNAU6.2/Lenti3 and pRNAU6.2/Lenti4, respectively. After being identified by restriction enzyme digestion and sequencing, the rebinant plasmids e digestion and DNA sequencing shoents id, and TGFβ1 expression in the transfected cells RNA level pared that in the control group (Plt;0.01). Conclusion The RNAi plasmid vector of TGFβ1 ing groid vector 转化生长因子β1(transforming groRNA的质粒干扰载体，将其转染Hela细胞后能高效地抑制TGFβ1的表达，为TGFβ1后续的基因治疗研究奠定了基础。 1 材料与方法 1.1 材料 限制性内切酶BamHⅠ、XhoⅠ和T4 DNA连接酶(TaKaRa)；pRNATU6.2/Lenti质粒载体(GenScript，含BamHⅠ、XhoⅠ酶切位点)；Tip100质粒抽提柱(QIAGEN)；大小Marker(TaKaRa)；Hela细胞(医学遗传学国家重点实验室惠赠)；逆转录试剂盒(Promega)；TGFβ1 ELISA试剂盒(RnD公司，晶美生物工程有限公司代理)；Lipofectamine 2000以及Trizol(Invitrogen)；寡核苷酸及引物(上海生物工程有限公司)。 1.2 载体的构建及鉴定 1.2.1 载体的构建 根据Reynolds等[2]的经验，以人TGFβ1 mRNA序列(GenBank：NM000660)为模板选择3段靶序列，然后根据其中一段靶序列(TTGAACTTGTCATAGATTTCG)设计一段阴性对照序列，此阴性对照序列和靶序列具有相同的组成，但两者mRNA没有同源性；经BLAST表明此4段序列均不与人任何其他cDNA序列同源。再根据以上4段序列分别设计合成4对寡核苷酸序列，每对包含一条正义链(sense)和一条反义链(antisense)(表1)；表1中第1、2、3组分别是针对3段靶序列设计的寡核苷酸序列，下划直线标记的部分是靶序列及反义靶序列；第4组是针对阴性对照序列设计的寡核苷酸序列，下划直线标记的部分是阴性对照序列及其反义序列；波浪线标记的是酶切位点，其中GGATCC为BamHⅠ酶切位点，CTCGAG为XhoⅠ酶切位点。4对