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常见流式项目检测(SOP) CD55/CD59测定 方法 流式细胞仪(BD FACScanto ll ) 原理： 双色直接免疫荧光法。近年的研究表明，红细胞和白细胞膜上CD55和CD59分子的表达量和缺乏表达细胞的数量对PNH诊断和鉴别有重要意义。血细胞(红细胞和白细胞)通过膜上的抗原分子与荧光素标记的CD55或CD59的单克隆抗体结合。用流式细胞仪检测CD55或CD59表达阳性细胞百分数。 标本采集与处理 受检者的准备? 检查对象生活饮食处于日常状态，空腹采血。 采集部位????? 静脉采血 抗凝剂??????? EDTA或肝素抗凝血 要求??? 1．样本量至少1ml。 2．样本应在采集后6小时内处理，冷冻的标本不能用。 3．溶血样本不能用。 试剂 品牌?????????????? 剂型??? 规格??? 贮存 BD 1，单克隆抗体????? 液体??? 1ml??? 2—8 2，全血溶血试剂??? 液体?? 100ml???? 室温 3，鞘液??????????? 液体??? 20L????? 室温 4，清洗液????????? 液体??? 5L?????? 室温 5，荧光微球??????? 液体??? 10ML???? 2-8质控品? BD公司产品，未开瓶的试剂于2-8保存，可在有效期内保持稳定，稀释的试剂于2-8可稳定2周；每天校准一次；遇特殊情况随时进行校准。 仪器 BD FACScanto ll 样本制备: (一)白细胞CD55／CD59检测 1．准备2支流式细胞仪专用管，分别标记；分别加入CD55／CD59 10ul和相应的同型对照10ul；分别向二管中加入样品100ul；避光15-20分钟。 2．溶血： BD FACSLysing(按说明书进行原液10倍纯净水稀释后使用) 稀释的溶血素37水浴预温后每管加600ul 混匀避光室温溶血8-10分钟。 3．用PBS洗涤离心 ； 4．上机测样； (二)红细胞CD55／CD59检测 1．准备2支流式细胞仪专用管，分别标记 2．分别加入CD55／CD59 10ul和相应的同型对照10ul。 3．向二管中加入1：200稀释的样品100ul（可根据红细胞的数量调整），避光15-20分钟。 4．洗涤离心。 5．混匀、上机测样。 报告结果 报告百分数 操作性能 精密度??? 批内五次重复CV2％ 灵敏度??? 500—1000个荧光素分子 参考值 CD5597%??????????? CD5997% PNH的临界值：RBC? CD5995%??? WBC? CD5990% PNH的诊断值：RBC? CD5991%??? 大部分80% 中性粒细胞CD5984% 临床意义 用于AA和PNH的诊断和分型诊断。PNH时CD55和CD59明显减低和缺如。 HLA-B27测定 方法 流式细胞仪(BD FACScanto ll ) 原理： 双色直接免疫荧光法。将HLA-B27-FITC/B7-PE单克隆抗体加入到全血中，与白细胞膜上相应的抗体结合，经过溶血、洗涤（和固定）等步骤后，在流式细胞仪上进行分析，测定HLA-B7阴性而HLA-B27阳性细胞的平均荧光强度和所占的百分比。 标本采集与处理 受检者的准备? 检查对象生活饮食处于日常状态，空腹采血。 采集部位????? 静脉采血 抗凝剂??????? EDTA或肝素抗凝血 要求??? 1．样本量至少1ml。 2．样本应在采集后6小时内处理，冷冻的标本不能用。 3．样本白细胞计数应在4.0-10.0×109/L之间。若10.0×109/L，????????????? 样本需要稀释，用PBS稀释；若4.0×109/L，应分离单个核细胞。 4．溶血样本不能用。 试剂 品牌?????????????? 剂型??? 规格??? 贮存 BD 1，单克隆抗体????? 液体??? 1ml??? 2—8 2，全血溶血试剂??? 液体?? 100ml???? 室温 3，鞘液??????????? 液体??? 20L????? 室温 4，清洗液????????? 液体??? 5L?????? 室温 5，荧光微球??????? 液体??? 10ML???? 2-8 质控品? BD公式产品，未开瓶的试剂于2-8保存，可在有效期内保持稳定，稀释的试剂于2-8可稳定2周；每天校准一次：遇特殊情况随时进行校准。 仪器 BD FACScanto ll 样本制备： 1)按照要求，分别向已编好号的试管中加入20 ul单克隆抗体和同型对照(IgG2a-FITC／IgG1-PE) 2)分别向试管中加入混匀的100u1抗凝血。 3)混匀，避光，室温孵育15-20分钟 4)溶血： BDFACSLysing(按说明书进行原液10倍纯净水稀释后使用) 稀释的溶血素37水浴预温后每管加600