波谱学在有机化合物结构解析中的应用.docVIP

波谱学在有机化合物结构解析中的应用 在研究有机化合物的过程中，往往要对未知物的结构加以测定，或要对所合成的目的物进行验证结构。其经典的方法有降解法和综合法但是经典的研究方法花费时间长，消耗样品多，操作手续繁近代物理方法有多种，有机化学中应用最广泛的波谱方法是质谱、紫外和可见光谱，红外光谱，以及核磁共振谱，一般简称“四谱”。技术因具有检测精确度高、分析速度快、所需样品和试剂少的优点,已成为蛋白质结构研究中最重要的分析工具之一。生物MS技术主要用于解决两个分析问题：一是精确测定生物大分子,如蛋白质、核苷酸和糖类等的分子质量,并提供分子结构信息;二是对存在于生命复杂体系中的微量或痕量小分子生物活性物质进行定性或定量分析。它在蛋白质结构的快速鉴定、序列分析、蛋白质定量分析、翻译后加工(修饰)及蛋白质相互作用等方面已有较为广泛的应用。 PMF的测定蛋白质结构特殊,相对分子质量大,MS测定多肽和蛋白质序列是根据MS碎片离子推导的,序列信息碎片主要是通过酰胺键断裂形成。将蛋白质绘制成肽谱是一种重要的序列测定方法。PMF 测定是指将未知蛋白质以特定的蛋白酶酶解为多肽片段后,用MS测得各个肽片段的精确分子质量,将所得的肽质量数据与标准数据库相比对,即有可能检索到相应的蛋白质,同时可获得诸如一级结构等多方面的信息。在PMF鉴定蛋白质中,目前最常用的方法是,采用2-DE技术将酶切得到的肽段进行分离,再利用MALDI-TOF-MS进行分析。MALDI-TOF-MS对被测物质量误差范围有较高的要求,故MALDI-TOF-MS仪采用了离子反射器和延迟提取技术,并通过内标校正,质量误差范围可达 ,目前样品制备、PMF分析、数据库搜索这一过程已实现自动化,实现了蛋白质的快速鉴定和高通量筛选。 肽序列的测定 由于PMF方法只有在MALDI-TOF-MS分析得到4个以上肽段的质量且数据库中存在这种蛋白质的信息时才能正确鉴定,因此不能用于鉴定不符合上述条件的蛋白,此时需要对肽段的序列信息,即肽序列标签(PST,为蛋白质序列中的5～6个氨基酸残基片段,具有很高的特异性)进行测定。肽序列测定方法是利用肽段裂解技术将肽段沿肽链断裂, 形成长度仅相差一个氨基酸的一系列肽片段(肽段分子的离子),对这些碎片离子系列综合分析,即可推断出肽段的氨基酸序列。较之传统的Edman降解末端测序技术,MS具有灵敏度高、速度快及不受末端封闭的限制的特点。目前,广泛使用的肽段裂解技术包括CID和源后衰变(PSD)两种。用串联MS分析多肽序列时,复杂的肽混合物无需分离即可通过CID直接测定肽段的氨基酸序列。原理为从一级MS产生的肽段中选择母离子,在第二级MS中,进一步与惰性气体碰撞形成N端碎片离子系列(B系列)和C端碎片离子系列(Y系列)。孙懿等利用串联MS鉴定了与鼻咽癌中高表达的p53蛋白聚集和失活相关的22个差异表达蛋白质,为阐明鼻咽癌病理机制提供了依据。近年来有人采用PSD-MALDI-MS技术测得肽序列。Ehmann等则利用MALDI-MS在血液中寻找与胰腺癌有关的生物标记物,并对其中最具代表性的3种标记物进行肽序列分析,其诊断敏感性可达100%,诊断特异性为98%,为胰腺癌的早期诊断提供了技术支持。但以上两种肽段裂解技术尚存在一些缺陷:在肽键断裂时对某低能量的肽键有偏好,如脯氨酸残基的氨基端和天冬氨酸残基的羧基端;且在串联MS图谱上,难以区分Ile和Leu以及Gln和Lys。故对于未知的肽段,目前MS测序技术还不可能取代Edman降解末端测序技术。但FT-ICR-MS特有的ECD可解决这些问题,故其在肽序列标签的测定方面有广阔的应用前景。 2.2蛋白质翻译后修饰的确定和鉴别 翻译后修饰(post-translational modifications),如磷酸化、糖基化等,是调控蛋白质活性和功能的重要方式,也是蛋白质结构研究的重要内容,因此确定和鉴别蛋白质的翻译后修饰具有重要意义。由于磷酸化肽段带负电荷,而MALDI-TOF-MS常用检测模式为正离子模式,其离子化效率低,大量非磷酸化肽段的信号抑制了磷酸化肽段的信号,且其PMF中缺少标志性离子,因此直接采用MALDI-TOF-MS 检测磷酸化修饰位点比较困难。通常是采用MALDI-TOF-MS与碱性磷酸酶的去磷酸化作用相结合的方法来鉴定磷酸化肽段。由于肽上的一个磷酸基团丢失,分子质量数便减少了80,通过分析磷酸酶作用前后肽谱的差异,即可确定磷酸化肽段及磷酸化位点的数目。MALDI-TOF还可通过PSD进行翻译后修饰的分析研究。PSD是利用亚稳离子在飞行管中裂解时释放能量,使得反射飞行MS模式下离子反射能量聚集,亚稳离子飞行时间缩短,质荷比降低,导致MS谱图发生改变,从而检测出磷酸化位点。通常,丝氨酸和苏氨酸磷酸化肽段会丢失磷酸(分子质