一些抗氧化酶活性的测定.docVIP

SOD、POD、MDA和蛋白质测定 （1）酶液的提取（可用于测定SOD、POD、MDA和蛋白质） 取0.5g样品加5ml 0.05M（pH7.8）的磷酸缓冲液冰浴研磨（2ml磨样，3ml冲洗）后转入10ml离心管中，4℃，10000rpm离心20min，上清液即为酶液 （2）SOD、POD、MDA和蛋白质的测定 1 SOD活性测定（NBT法） 试剂药品：0.05M 磷酸缓冲液（pH7.8）；130mM 甲硫氨酸（Met）；750μM氮蓝四唑（NBT）；100μM EDTA-2Na；20μM 核黄素 ② 将1支暗对照管置暗处，其余样品日光下（4000lx）反应20min（时间可自行调节，反应体系颜色变化即可）。以暗对昭作空白调零，测定光对照及样品560nm处吸光值。 ③ 计算SOD活性（U/g）=（（Ack-AE）·VT·D）/（0.5·Ack·W·VR） （SOD活性单位以抑制NBT光化还原的50%为一个酶活性单位） Ack：光对照管吸光度 AE ：样品管吸光度 VT：酶提取液总体积（ml） VR：测定时酶液用量（ml） W：样品鲜重（g） D：稀释倍数 2 POD活性测定（愈创木酚法） 试剂药品：0.05M 磷酸缓冲液（pH5.5）；0.2%愈创木酚溶液；0.3% H2O2 最后加入H2O2或愈创木酚启动反应，可使反应体系混合更均匀 ② 以PBS pH5.5为对照调零，记录470nm处吸光值（以每1min增加0.01定义为1个酶活性单位） ③ POD活性（U/（g·min））=（ΔA470·VT·D）/（0.01·W·VR·t） ΔA470：反应时间内吸光度的变化 VT：总的酶液提取液体积（ml） D：稀释倍数 VR：测定时的酶液体积（ml） W：样品鲜重（g） t：反应时间（min） 3 MDA含量测定（TBA法） 试剂药品：0.6% TBA ① 反应体系：1ml提取液+2ml 0.6% TBA，沸水浴15min，冷却离心，取上清在600,532,450nm下测定吸光值 ② MDA含量计算： 反应混合液中MDA浓度C（μmol/L）=（6.45·（A532-A600））-（0.56·A450） 提取液中MDA浓度（μmol/ml）=（CMDA·反应液体积ml）/（测定时提取液用量ml·1000） 样品中MDA含量（μmol·g-1·Fw）=（提取液中MDA浓度·提取液总量ml）/植物组织鲜重g 4 蛋白质含量测定（考马斯亮蓝G-250法） 试剂药品：考马斯亮蓝 ① 标准曲线制作：参照《植物生理生化试验原理和技术》（王学奎版）191页 ② 提取液在室温下放置0.5-1h以充分提取，5ml考马斯亮蓝+100μL提取液（用量可调节），混匀，反应2-5min后，在595nm下比色 蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合反应十分迅速，在2min左右反应达到平衡，其颜色可在1h内保持稳定，且在5-20min内颜色的稳定性最好 ③ 样品中蛋白质含量（mg/g鲜质量）=（X·VT·N）/（W·VS·1000） X：根据样品的吸光度所查得的标准曲线值（蛋白质质量μg） VT：提取液总体积ml W：样品鲜质量g VS：测定时加样量ml N：稀释倍数 叶绿素含量的测定 试剂药品：95% 乙醇 ① 取叶片0.1-0.2g，剪成小块放入刻度试管，加95% 乙醇，于暗处放置12h，待叶片绿色褪尽，即可在665、649nm波长下测定吸光值 ② 叶绿素含量计算： Ca=13.95·A665-6.88·A649 Cb=24.96·A649-7.32·A665 叶绿素含量（mg/g）=（C·V·N）/（W·1000） C：叶绿素a+b含量（mg/L） V：提取液体积ml N：稀释倍数 W：样品鲜质量或干质量g GSH、AsA含量测定 测定液的提取 取一定部位的植物叶片(视需要而定，去叶脉)0.5g剪碎加入5mL 5% 三氯乙酸(TCA)溶液，研磨， 15000r/min离心10min，上清液定容至5mL。 GSH含量的测定 试剂药品：5%三氯乙酸（TCA）溶液；150mM NaH2PO4（pH7.7）溶液；100mM 磷酸缓冲液（pH6.8）；DTNB试剂（75.3mg DNTB溶于30ml 100mM pH6.8 PBS中） ① GSH标准曲线的制作：配置浓度分别为0mM、0.02mM、0.04mM、0.06mM、0.08mM、0.10mM、0.12 mM的标准GSH