真核表达载体ppdgf-nep的构建及表达.docVIP

真核表达载体pPDGF-NEP的构建及表达 一、真核表达载体pPDGF-NEP的构建 （一）、材料 各种Taq酶、T4DNA连接酶、限制性内切酶、所有DNA marker及凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒均购自大连Takara公司；全血基因组DNA提取试剂盒购自上海生工生物工程技术服务有限公司。 质粒pSIMPLE-19 EcoRⅤ/BAP载体购自大连Takara公司；真核表达质粒pEGFP-1、质粒pcDNA3.1(+)、质粒pCSC-SPPW-net由山东大学医学院生物化学与分子生物学研究所保存。 （二）、方法 2.1. PDGF启动子的获取 用全血基因组DNA提取试剂盒提取人外周血基因组DNA，根据Genbank上的PDGF基因全序列（Genbank：HSN 10C 3,2782bp,该序列中含有一个EcoRⅠ酶切位点）设计多对引物，并在上下游外引物F/R上分别加入Bsp106及KpnⅠ酶切位点。第一步先以基因组DNA为模板，分别使用内引物F0/R1、F1/R进行分段PCR扩增，获得PCR产物1和PCR产物2。第二步以PCR产物1和PCR产物2为模板，以外引物F/R进行PCR扩增，扩增产物即为2782bp的PDGF启动子序列。第三步将上一步获得的PCR产物通过酶切插入至pSIMPLE-19 EcoRⅤ/BAP载体中构建pSIMPLE-19-PDGF，并进行酶切、测序鉴定和扩增（实验步骤见图1）。各引物序列： F0：5’-CTTACGGGCTGTGTGACCTT-3’； F：5’-ATCGATAGCATGGAGAGGCTACAGGTAGAGT-3’； F1：5’-TCTCTGCCACTGTGCCACGCT-3’； R：5’-GGTACCGGCAGTCGATGGTTCGTCTTCACTC-3’； R1：5’-AGCGTGGCACAGTGGCAGAGA-3’。 图1 神经特异性启动子PDGF promoter的调取 2.2. NEP基因的获取 根据NCBI Genbank提供NEP、β-actin的基因序列，β-actin： F 5’-ACACTGTGCCCATCTACGAGGGG-3’， R 5’-ATGATGGAGTTGAAGGTAGTTTCGTGGAT-3’； 引物NEP：F5’-AAAGCTAAAAAGAAAACAG-3’，R 5’-CAGTGCCAACAAACAAAT-3’，扩增片段大小分别为395、575bp，引物为上海博亚公司合成。 从质粒pCSC-SPPW-net上用ApaⅠ切出含NEP片段，同时将质粒PEGFP-1用ApaⅠ酶切，线性化，用碱性磷酸酶处理防止载体自身环化，然后电泳回收NEP片段和线性化的质粒PEGFP-1，用T4DNA连接酶过夜连接，转化，挑单克隆在培养液中培养，提质粒，酶切测序鉴定正反向，用BamHＩ、KpnⅠ切下NEP片段，得到两端带有KpnⅠ、BamHＩ酶切位点的NEP片段。同时用BamHＩ、NotⅠ双酶切质粒pcDNA3.1(+)，胶回收小片段适配子和带有KpnⅠ、BamHＩ酶切位点的NEP片段，用T4DNA连接酶过夜连接，最后得到两端带有KpnⅠ，NotⅠ酶切位点的目的基因片段。取一小部分整片段电泳鉴定以及酶切鉴定正确后，待用。 2.3. pPDGF-EGFP的构建 使用Bsp106和KpnⅠ双酶切质粒pSIMPLE-19-PDGF获得PDGF启动子片段，用HindⅢ和KpnⅠ双酶切质粒P-EGFP -1获得载体大片段。将上述获得的两个片段与两端含有HindⅢ和Bsp106末端的适配子进行3片段连接，构建真核表达载体pPDGF-EGFP。适配子序列： F：5’-AGCTTCGAATTCTGCAGTCGACGGTACCGCGGGCCCGAT； R：5’-CGATCGGGCCCGCGGTACCGTCGACTGCAGAATTCGA。 2.4. pPDGF-NEP的构建 使用KpnⅠ和NotⅠ双酶切质粒pPDGF-EGFP获得含启动子PDGF的大片段，将含启动子PDGF的大片段和带有KpnⅠ，NotⅠ酶切位点的目的基因NEP片段，用T4DNA连接酶过夜连接，最后得到真核表达载体pPDGF-NEP。 二、检测重组载体pPDGF-NEP的神经组织特异性表达情况 （一）、材料 RNA提取试剂盒（Trizol试剂）、所有DNA Marker及凝胶回收试剂盒均购自大连RAKARA公司；质粒提取试剂盒、脂质体LipofectamineTM2000购自Invitrogen公司；NEP多克隆抗体系美国Santa Cruz生物公司产品；β-actin单克隆抗体由美国Cell Signaling公司提供；抗NEP、β-actin辣根过氧化酶标记的二抗系北京中杉金桥生物技术有限公司生产；ECL（增强化学发光检测系统