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HALA细胞工程实验培养方案 背景知识：Hela Cells是细胞学与医学研究中使用的一种细胞，源自一位美国妇女海莉耶塔·拉克斯（Henrietta Lacks）的子宫颈癌细胞的细胞系。这名美国妇女在1951年死于该癌症。为了让拉克斯保持匿名，此细胞株原宣称是依“Helen Lane”命名。HeLa细胞系被视为“不死的”（即不同于其他一般的人类细胞，此细胞株不会衰老致死，并可以无限分裂下去），至今都被不间断的培养。此细胞系跟其他癌细胞相比，增殖异常迅速。海拉细胞系被George Gey分送给众研究单位（并未通知拉克斯本人也未得到她的许可），并用作癌症模式细胞研究。HeLa细胞系也被用作研究细胞信号传导。海拉细胞系是被人类乳突病毒第18型转化的，和正常子宫颈细胞有许多不同。已证实海拉细胞系难以控制。此细胞系有时会污染同一实验室的其他细胞培养物，干扰生物学的研究。污染程度难以估计，因为研究人员很少检定已确立细胞系的本质和纯度。据说有相当数目的体外细胞系其实就是HeLa细胞系，因为原先的细胞株已被快速增殖的HeLa细胞系污染物取代了。 实验原理： (1)细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融，实验证明这样可以最大限度的保存细胞活力。目前细胞冻存多采用甘油或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质能提高细胞膜对水的通透性，加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。复苏细胞应采用快速融化的方法，这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。 passage）或再培养（subculture）意义： ①细胞生长、增殖的需要； ②扩大培养，获得大量同种细胞，为后续研究做准备。 传代的时机：单层培养细胞长满培养面积的80％左右。 （3）胞培养工作中，常需要了解细胞生活状态和鉴别细胞死活，确定细胞接种浓度和数量以及了解细胞存活率和增殖度，如用酶消化制备的细胞悬液中细胞活力的鉴别，冻存细胞复苏后的活力检测等。细胞悬液制备后，常用活体染料台盼蓝对细胞进行染色，进行细胞计数。台盼蓝不能透过活细胞正常完整的细胞膜，故活细胞不着色。而死亡细胞的细胞膜通透性增高，可使染料进入细胞内而使细胞着色（蓝色）。细胞计数一般用血细胞计数板，按白细胞计数方法进行计数，便于确定细胞的生活状况。 ℃温水并不断搅拌。使冻存管中的冻存物在1min之内融化； 打开冻存管，将细胞悬液吸到离心管中。 1000r/min离心10min，弃去上清液； 沉淀加10ml培养液，吹打均匀，再离心10min,弃去上清液； 加适当培养基后将细胞转移至培养瓶中，37℃培养，第二天观察生长状况。 计数 仪器：普通显微镜 血细胞计数板 试管、吸管 24孔培养板 液闪计数器 材料：HaLa细胞悬液 试剂：0.4%台盼蓝染液 实验步骤： 将血细胞计数板及盖片擦洗干净，并将盖片盖在计数板上； 取吸管一支，深入培养瓶中，轻轻反复吹打细胞悬液使细胞重悬均匀后，立即吸细胞悬液少许，向另一离心管滴入细胞悬液9滴，再滴入台盼蓝染液1滴，混匀，置2~3min； 把计数板平放在显微镜台上，立即从计数板边缘轻轻滴1~2滴已染色的细胞悬液，使之充满计数板和盖片间空隙中； 镜下观察可见细胞分散各处，健康细胞胞体完整，透明不着色，凡着色细胞均为不健康者。计算四角大方格的细胞数，压中中线只计算左线和上线着，右线和下线不计算在内，然后按一下公式计算： 细胞密度（个/ml)=平均细胞数××稀释倍数。每个方格的容积为1×。 细胞总数（个）=细胞浓度×细胞悬液量 传代 仪器：倒置显微镜、C02培养箱、超净工作台、培养瓶、吸管、废液缸、酒精灯、75%酒精 材料：Hela细胞株 试剂：培养基(RPMI1640或DMEM)，小牛血清或胎牛血清， PBS缓冲 液 ，0.2%胰蛋白酶，Hank’s液 ， 0.25%胰蛋白酶 实验步骤 1．观察培养基是否正常，细胞状态如何，细胞密度如何，决定是否传代。观察时拧紧盖子。 ．打开超净台（先开风机，后开照明），用75%乙醇清洁台面，点燃酒精灯。．取待传代的细胞。打开EDTA，用酒精灯外焰烧。烧吸管时距离酒精灯心远些，不要把渣滓带进去。．用吸量管加入EDTA，然后将EDTA瓶收起来。（加EDTA主要是为了将旧培养基洗去。吸液体和加液体时都不要对着细胞。 5．打开胰酶，用尖吸管吸取适量胰酶加入。加胰酶后，尽快放平，使细胞消化时间一致。 ．将细胞放入37度孵箱。放C022min,在倒置显微镜下随时观察当发现胞质回缩、细胞间隙增大后，应立即