乳品真蛋白检测技术.docVIP

乳品中真蛋白检测方法总结 1．乳及乳制品中真蛋白的概述 通过测定总氮含量而计算得到的蛋白质含量称为粗蛋白( crude p rotein, CP) ,目前国家标准方法中测定的即为粗蛋白含量。乳中的氮含量包括蛋白态氮(protein nitrogen, PN)和非蛋白态氮( non2p roteinnitrogen, NPN) ,其中前者占95% ,后者约占5%。蛋白质是乳中的主要含氮物质,含量约218% ～318%。乳蛋白包括酪蛋白、乳清蛋白及少量脂肪球膜蛋白。乳清蛋白中有对热不稳定的乳白蛋白和乳球蛋白,上述蛋白构成了乳中的“真蛋白”[1]。蛋白质是牛奶的主要成分，且牛奶中的蛋白质是完全的蛋白质，由于含有人体必需的氨基酸，所以营养价值很高，牛奶中的蛋白质消化率可以达到90%～100%[2]。乳中其他含氮物主要来源于乳中的氨、尿素、肌酸、肌酸酐、尿酸、乳清酸、多肽、马尿酸、氨基酸和其他成分,这些成分构成了非蛋白质氮。 真蛋白( true p rotein, TP)即真正的蛋白质,在测定方面可定义为除了非蛋白质氮以外的蛋白态氮所计算得到的蛋白,正常情况下,天然乳中真蛋白的含量少于粗蛋白。酪蛋白是乳品真蛋白中最重要的蛋白质,主要以胶束状态存在于乳中,它是以含磷蛋白质为主体的几种蛋白质的复合体,主要分为αs12酪蛋白、αs22酪蛋白、β2酪蛋白和κ2酪蛋白4种。一般情况下,乳品真蛋白中约有80%为酪蛋白,但其含量因个体差异、牧场管理、乳牛品种的不同而变化[1]。 2.乳及乳制品中真蛋白测定的研究背景 牛奶及乳制品中含有丰富的蛋白质，但在牛奶收购、生产环节中，质量掺假事件时有发生，尤以“劣质假奶粉”事件和“三聚氰胺奶粉”事件为甚。目前，乳制品的消费量很大，根据FAO统计，世界人均年消费乳制品46kg，是日常饮食结构的重要组成部分，它的安全性直接影响到人们的身体健康，所以一旦出现质量或安全问题，它暴露的受害人群和风险就会高一些。尤其牛奶对婴幼儿有代母乳的作用，在婴儿成长的特定阶段，成为其全部营养来源，因而，乳制品的安全至关重要，世界各国都对乳制品的质量控制制定了相当严密的标准体系[2]。 目前检测蛋白质的国家标准方法是凯氏定氮法，其结果只是氮的质量分数， 而不是真正意义上的蛋白质质量分数。这种缺陷造成某些不法分子对牛奶进行掺假，添加硫酸铵、三聚氰胺、水解植物或动物蛋白等含氮物质。要杜绝这类问题，必须建立真蛋白质的检测方法[3]。 3.乳品中真蛋白的测定方法 3.1 电位滴定法 2009年唐伟英等人[4]为排除牛乳中三聚氰胺等非蛋白氮的干扰， 探索研究了电位滴定法测定牛乳中真蛋白的含量。它的基本原理为：蛋白质的两端有游离的具有酸性的羧基（－COOH）和碱性的氨基（－NH2）， 当加入甲醛溶液时， 氨基上的两个氢原子被次甲基所取代， 于是便失去了氨基的碱性特性， 从而使其呈酸性的羧基释放出来， 使溶液的电化学特性发生变化。再用氢氧化钠标准溶液滴定游离的羧基（－COOH）， 从而用经验公式计算其蛋白质含量。 与凯式定氮法相比，该法可以排除三聚氰胺、尿素对牛乳中蛋白质测定的干扰，其次该方法所需检测仪器及试剂常规，操作简便，而且大大缩短了测定时间，提高了工作效率，具有一定的推广使用价值。但从其原理中不难得出此法不能排除铵态氮（氯化铵、硫酸铵、碳酸铵等）的干扰，有一定的局限性。针对这一漏洞唐英伟等人在2009年提出了改进方法即：在测定前在试样中加入浓碱液加热检查有无氨气放出， 验证有无铵态氮。若有， 则先将铵态氮分离出去， 再用电位滴定法测定； 若没有，则可直接用电位滴定法测定。 3.2 三氯乙酸-双缩脲比色法 该方法的基本原理为：采用150 g/L 的三氯乙酸溶液(在混合物中的最终浓度约为120 g/L )沉淀乳中的蛋白质,用过滤法分离沉淀和溶液,沉淀部分含蛋白态氮,非沉淀部分(溶液)含非蛋白态氮。将滤渣收集起来,再用双缩脲法进行定氮。即可得出样品中的真蛋白含量。2011年侯彩云等[5]人利用该方法提出了真蛋白率这一概念。并测定了添加过乳清蛋白乳粉的蛋白质量分数。结果表明，乳清蛋白的加标回收率在89.2%~99%之间，重现性在0.26%~0.98%之间，表明三氯乙酸-双缩脲比色法可以较好地检测出乳中的真蛋白。 该方法是对凯式定氮法的改进，在样品检测前先将其中的蛋白质沉淀，可以很好的排除三聚氰胺、尿素等非蛋白氮的干扰。后期采用双缩脲法对滤渣进行蛋白质含量测定，且操作简便迅速，可提高工作效率，但灵敏度比较低,测定范围为1～20 mg 蛋白质,适用于精度要求不高的蛋白质含量测定。 3.3 紫外分光光度法 紫外分光光度法的基本原理[6]为：蛋白质中含带共轭双键的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基,使蛋白质具有吸收紫外光的性质,其吸收峰在280 nm 处,吸光度与