构建一种可评价脂肪间充质干细胞成骨向分化的荧光素酶报告系统.pdfVIP

北 京 大 学 学 报 ( 医 学 版 ) · 170 · JOURNALOFPEKINGUNIVERSITY(HEALTHSCIENCES) · 技 术 方 法 · 构建一种可评价脂肪问充质干细胞成骨向分化的 荧光素酶报告系统 葛雯妹 ，汤袢熳 ，张 晓 ，刘云松 ，周永胜 (北京大学口腔医学院 ·口腔医院1．综合二科 ，2．修复科 ，北京 100081) [摘 要]目的：构建一种可用于评价人脂肪问充质干细胞 (humanadipose—derivedstemcells，hASCs)成骨向分化的 荧光素酶报告系统，以期能够快捷 、特异且定量的检测出细胞在体外的成骨向分化情况，并且使将来活体监测小型 实验动物外源移植细胞的成骨分化成为可能。方法：将骨钙素(osteocalsin，OC)基因的启动子克隆到荧光素酶lu— eiferase报告基因的上游，构建 pLVX—OCpro-LUC—Puro载体，进行慢病毒包装后感染人脂肪间充质干细胞 ，嘌呤霉素 (puromycin)筛选阳性克隆，获得稳定整合 0cpro—LUC—Puro的细胞株，将该细胞在成骨诱导培养基中培养的第 7和 14天 ，观察其在成骨诱导环境下分化的情况。在成骨诱导培养的第7和 14天检测荧光素酶的活性，同时进行茜素 红(AlizarinredS)染色定量及成骨相关基因表达水平的检测，通过比较验证该荧光素酶报告系统用于成骨评价的 可行性。结果：成功构建pLVX—OC。。-Luc—Puro载体获得稳定整合报告基因的hASCs细胞株。在 OCpro—Luc—Puro— hASCs成骨诱导的第 7和 14天，茜素红钙化结节染色结果均为阳性，且第 14天的染色及定量结果明显强于第 7 天。OC、Runx2及碱性磷酸酶 (alkalinephosphatase，ALP)基因的mRNA水平在成骨分化刺激下 ，其表达水平逐渐上 升，同时，荧光素酶被激活，且荧光素酶的活性在第 14天明显强于第 7天，即荧光素酶表达的趋势与茜素红染色定 量及成骨相关基因表达水平一致。结论：成功构建了一种可用于评价成骨向分化的荧光素酶报告系统，并通过与 传统的检测成骨向分化方法 (茜素红染色定量 、成骨相关基因表达)对比，验证了该系统的有效性。 [关键词]荧光素酶类；脂肪组织；间充质干细胞 ；骨生成；细胞分化 [中图分类号]R329．28 [文献标志码]A [文章编号]1671—167X(2016)01-0170-05 doi：10．3969／j．issn．1671—167X．2016．01．031 Establishingaluciferasereportersystem toevaluateosteogenicdifferentiationpoten- tialofhumanadipose．derivedstem cells GEW en．shu ，TANG Yi—man ，ZHANG Xiao2 LIU Yun．song ，ZHOU Yong—sheng。 ， (1．DepartmentofGeneralDentistry Ⅱ；2．DepartmentofProsthodontics，PekingUniversitySchoolandHospitalofStoma— tology，Beijing100081，China) ABSTRACT Objeetive：Humanadipose．derivedstem cells(hASCs)areahighlyattractivesourcein bonetissueengineering．Togeneratealuciferasereportersystem thatcouldbeusedtoquantitativelyand rapidlyexamineosteogenicdifferentiationpotentialofhuman adipose．derivedstem cells (hASCs) n vitro．andeventuallymakeitpossibletomonitortheosteogenicdifferen