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药理学实验II（细胞药理学）唐超 本次实验一共分三个内容，分别是细胞计数、药物溶剂在hela细胞中的毒性和细胞传代。 实验一、细胞的计数 操作步骤： 用移液管吹打MT-4悬浮细胞制成细胞悬液。 取清洁的血球计数板，盖上盖玻片，取少许上述混合液（约15微升）从盖玻片边缘加入，弥散至整个槽面，避免产生气泡。 镜下计数四个大方格的细胞总数，除以4，再乘以稀释倍数，最后乘以10000，为每毫升细胞悬浮液中的细胞数。 注意事项： 每一大个体积为1立方毫米。 若细胞位于线上，计数的原则是：记上不记下，记左不计右。 实验二、药物、溶剂在Hela细胞中的毒性实验 实验目的： 掌握在细胞水平测试药物或溶剂对细胞的毒性实验设计及操作技术。 掌握CCK-8法测定细胞活力的原理和方法。 掌握药物细胞半数中毒浓度（TC50）的计算方法。 材料和试剂： 细胞：Hela细胞 样品：甲醇、乙醇、DMSO、待测样品X（每组做两种样品） CCK-8溶液、DEME完全培养基 酶标仪、96孔培养板、微量移液器、CO2培养箱、倒置显微镜等 操作步骤： 稀释溶液：1:1、1:2、1：4、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128、1:256九个浓度，每个稀释度四个复孔，每孔加样100微升。 稀释待测样品X：1:10、1:20、1:40、1:80、1:160、1：320、1:640、1:1280、1:2560、1:5120、1:10240十一个稀释度，没个稀释度4个复孔，每孔加样100微升。 取前一日接种Hela细胞的96孔板，细胞接种密度为6000/孔。 弃去培养基，加入100微升上述稀释的溶剂或待测样品。 设立细胞对照，弃去培养基，加入100微升培养基。 于37摄氏度，5%CO2培养箱，逐日观察细胞形态。 第三天，每孔加入10微升CCK-8溶液，轻轻拍打培养板混匀。37摄氏度孵育1-4h。 酶标仪测定450nm/630nm处的A值。 结果判定 计算各稀释度药液组成的A均值。 以A均值为纵坐标，药物稀释倍数的对数为横坐标绘制散点图，计算回归方程。 计算药物的半数中毒浓度（TC50）。 实验三、哺乳动物细胞的传代（实验演示） 实验目的： 掌握哺乳动物细胞传代培养基本操作步骤。 材料和试剂： 培养中的Hela细胞、MY-4 倒置显微镜、移液管、离心管、培养瓶等 RPMI1640培养基、DMEM培养基、无菌PBS、0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA混合消化液等。 操作步骤： 将成长单层的Hela细胞从二氧化碳培养箱中取出，在生物安全柜中弃掉瓶内的培养基，用无菌PBS洗涤细胞一次，加入0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA混合消化液，37摄氏度作用三到五分钟。 倒置显微镜下观察，当细胞将要分离而成圆粒状时，轻轻吹打瓶壁使细胞脱落，反复吹打使细胞分散均匀。 将细胞悬浮液依比例转移到另一无菌培养瓶中，并向每个瓶中加入约5毫升培养基，吹打摇匀。拧紧瓶塞，放回二氧化碳培养箱中继续培养。 悬浮细胞 吸出细胞培养液、放入离心管中，1000rpm离心5分钟。 吸取上清液，加入适量完全培养基，混合均匀后，以稀释比例转移至新的培养基瓶中，吹打混匀，37摄氏度，5%二氧化碳培养箱中继续培养。 实验数据分析： 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 吸光度（A） 0.005 0.151 0.216 0.189 0.161 0.548 0.621 0.865 1.483 0.141 0.006 0.148 0.174 0.189 0.272 0.454 0.717 0.872 2.077 0.137 0.004 0.159 0.159 0.175 0.255 0.057 0.595 0.944 1.396 0.147 0.005 1.142 1.142 0.162 0.293 0.411 0.755 1.08 2.709 0.15 平均数（A） 0.005 0.4 0.42275 0.17875 0.24525 0.3675 0.672 0.94025 1.91625 0.14375 细胞浓度（万/ml） 空白 2.34395 4.6875 0.9375 1.875 3.75 7.5 15 30 0 DMSO 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 吸光度（A） 2.162 1.355 1.69 1.36 0.968 2.464 1.836 1.387 1.935 0.467 1.505 2.072 1.54 0.085 1.261 0.935 0.123 1.207 1.598 1.531 1.986 2.046 1.685 1.431 1.191 0.725 1.003 1.215 1.681 2.387 1.7