第8章_PCR技术及其应用.pptVIP

* 西南大学生物技术专业 基因工程 * 二、荧光标记方式 1、SYBR Green荧光染料： 它结合到双链DNA的小沟中后发出荧光，非结合状态不发出荧光，最大吸收波长为497nm，最大发射波长为520nm，通用性好，灵敏度高，价格相对较低。 缺点是对DNA没有选择性，特异性不强，对PCR引物设计的特异性和PCR反应的质量要求较高。 应用较为广泛。 2、水解探针(TaqMan探针) 利用Taq酶的5’→3’外切酶活性，在PCR反应系统中加入一个荧光标记探针。该探针可与引物包含序列内的DNA模板发生特异性杂交，探针的5’端标以荧光发射基因FAM（荧光发射峰值在518nm处），靠近3’端标以荧光淬灭基团TAMRA（荧光发射峰值在582nm处），探针的3’端被磷酸化以防止探针在PCR扩增过程中被延伸。 当探针保持完整时，淬灭基团抑制发射基团的荧光发射。发射基团一旦与淬灭基团发生分离，抑制作用被解除，518nm处的光密度增加而被荧光探测系统检测到。 复性期探针与模板DNA发生杂交，延伸期Taq酶随引物延伸沿DNA模板移动，当移动到探针切断,淬灭作用被解除，荧光信号释放出来。模板每复制一次，就有一个探针被切断，伴随一个荧光信号的释放。 特点：特异性很高，特别适合SNP检测，设计相对简单，但成本高，只适合一个特定的目标，且不能进行融解曲线分析。 实时PCR技术原理 探针设计一般应符合以下条件： ①探针长度应在20～40个碱基左右，保证结合特异性。 ②GC碱基含量在40%～60%，避免单核苷酸序列的重复。 ③避免与引物发生杂交或重叠。 ④探针与模板结合稳定程度要大于引物与模板结合的稳定程度，因此探针的Tm值要比引物的Tm值至少高出5℃。 另外，探针的浓度、探针与模板序列的同源性，探针与引物的距离都对实验结果有影响。 * 西南大学生物技术专业 基因工程 * 3、发夹型杂交探针又叫分子信标(molecular beacon)，是加入了荧光基团和淬灭基团的探针，但在结构上是环状的寡核苷酸探针，由茎部和环部组成，其中茎由互补配对的序列组成，环与目的序列完成配对，探针分子的两端分别标记荧光报告基团和荧光淬灭基团。当探针无杂交时，分子内淬灭不发光，当发生杂交时，分子内的荧光报告基团和荧光淬灭基团的距离分开，发出荧光。特点：很高的特异性，背景低，但探针设计困难，无终点分析功能，只能用于一个特定的目标，价格较高。 PCR技术的应用 研究 基因克隆，DNA测序，分析突变 诊断 细菌、病毒、寄生虫检测，诊断 人类基因组工程 遗传图谱的构建，DNA测序，表达图谱 法医 犯罪现场标本分析 肿瘤 各种肿瘤检测 其他…… 凡是生命科学领域，PCR都有用武之地。 西南大学生物技术专业 基因工程 * 西南大学生物技术专业 基因工程 * 西南大学生物技术专业 基因工程 * 西南大学生物技术专业 基因工程 * 西南大学生物技术专业 基因工程 * 西南大学生物技术专业 基因工程 * 1 2 3 4 5 22 55 72 94 时间（min） 温度 （℃） 适温延伸 3 高温变性 1 低温退火 2 重复1~3步 25~30轮 目的DNA片段 扩增100万倍以上 DNA双螺旋 DNA单链 与引物复性 DNA变性 形成2条单链 子链延伸 DNA加倍 模板DNA 95℃ PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 50℃ 引物1 引物2 DNA引物 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 引物1 引物2 DNA引物 72℃ Taq酶 Taq酶 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 72℃ 第1轮结束 第2轮开始 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 95℃ 50℃ 72℃ Taq Taq Taq Taq PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 72℃ 第2轮结束 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 重复30轮后 230=1,073,741,824 模板DNA 第1轮扩增 第2轮扩增 第3轮扩增 第4轮扩增 第5轮扩增 第6轮扩增 理想拷贝数=2n n 循环次数 实际拷贝数=(1+x)n X 平均效率,约为0.85 n 循环次数 PCR的特点 灵敏度高 皮克(pg=10-12)量级扩增到微克(ug=10-6)水平 能从100万个细胞中检出一个靶细胞 病毒检测的灵敏度可达3个RFU 细菌检测的最小检出率为3个细菌 简便、快速 一次性加好反应液，2～4 小时完成扩增 扩增产物一般用电泳分析 对标本的纯度要求低 血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等组织的粗提DNA PCR中其它注意的