大蒜中超氧化物歧化酶提取与纯化.docVIP

广东石油化工学院 实 验 报 告 生物技术系 专 业 生物技术 班 别 学号 姓 名 同组人 实验课程 大蒜中超氧化物歧化酶提取与纯化 实验日期 2011-6-13至2011-6-21 成 绩 大蒜中超氧化物歧化酶提取与纯化 一、实验目的： 1.学习并掌握大蒜SOD提取与纯化的方法及原理。 2.学习并掌握DEAE-纤维素离子交换层析分离纯化蛋白质的操作方法。 3.学习并掌握SDS法测定蛋白质分子量的方法。 4.学习并掌握邻苯三酚自氧化法测定SOD酶活的方法。 5.熟悉考马斯亮蓝测定蛋白含量的实验原理和方法。 二、实验原理： 超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD5)广泛存在于动植物及微生物体内，可催化细胞内超氧负离子( O2-) 的歧化反应，使 O2-转化为 H2O2 和 O2。因此，SOD是一种具有抗脂质氧化、抗衰老、抗辐射和消炎作用的药用酶及功能性酶，在医药、食品、化妆品等领域有着广阔的应用前景。 SOD是一种亲水性的酸性酶蛋白，在酶分子上共价连结金属辅基，按照其结合的金属离子，主要可分为Fe-SOD、Mn-SOD和Cu/Zn-SOD 3种。Cu/Zn-SOD是分布最广而且是最重要的SOD，主要存在于真核细胞的细胞浆内，分子量约为32KD，一般由两个亚基组成。SOD对热、pH以及某些理化性质有很强的稳定性，即使温度达到60℃，经短时处理酶活几乎无损失；同时，酶活性不受乙醇和氯仿影响，但Cu/Zn-SOD对氰化物及过氧化氢均敏感。SOD不溶于丙酮，可用丙酮将其沉淀析出。Cu/Zn-SOD由于色氨酸含量低，其最大紫外吸收为258nm，由于含铜，所以在可见光680nm处有最大吸收。 国内测定SOD活力一般采用邻苯三酚自氧化法或改良的邻苯三酚自氧化法。在碱性条件下，邻苯三酚会迅速自养化生成有色中间产物，同时生成超氧负离子（O2-）。中间产物在325 nm 和420nm 波长处均有强烈的光吸收。邻苯三酚的自氧化速率与O2-的浓度有关。当有SOD存在时，由于它可催化超氧负离子(O2-) 的歧化反应，生成氧和过氧化氢：，从而抑制邻苯三酚的自氧化，阻止了中间产物的积累。因此，可通过监测 SOD 对这个反应的抑制程度间接测定 SOD 活力。大蒜中的SOD正属于Cu/Zn-SOD。 三、实验材料 实验材料：大蒜 四、实验操作步骤 1、粗酶液制备与沉淀分离 [试剂和器材]： (1)　材料　市售新鲜大蒜. (2)　仪器　恒温水浴 、离心机、 布氏漏斗、抽滤瓶 烧杯、量筒、搅棒、 透析袋 、搅拌机 (3)　试剂　-18℃预冷的丙酮、磷酸缓冲液（pH7.8, 0.05mol/L） [方法和步骤] 1、将蒜瓣去外膜,于搅拌机中搅拌10min后移至研钵中研磨至蒜泥状 2、SOD粗提取方法 磷酸缓冲液法： 加入3倍体积(mL/mg)的磷酸缓冲液,浸泡30~45min后用6层纱布抽滤.将滤渣再用2倍磷酸缓冲液浸泡30min后, 6层纱布抽滤.如此反复共3次,收集3次抽滤所得滤液,测酶活力. 热变性法： 将大蒜中SOD酶液于60℃热处理20min, 8 500r/min离心10min,弃沉淀,测定上清液酶活力. 3、SOD纯化沉淀分离方法 丙酮沉淀： 将酶液置于冰浴中,加入等体积经-18℃预冷的丙酮,搅拌15min,于4 500r/min离心15min,弃上清液,用50mmol/L磷酸缓冲液溶解其沉淀后,透析磷酸缓冲液, 4 500r/min离心10min,测定上清液的SOD酶活力。 2.离子交换层析纯化超氧化物歧化酶 [原理] 离子交换层析是依据各种离子或离子化合物与离子交换剂的结合能力不同而进行分离纯化的。离子交换层析的固定相是离子交换剂，以液体为流动相。离子交换剂由一类不溶于水的惰性高分子聚合物基质，通过一定的化学反应共价结合上某种电荷基团形成。离子交换剂可以分为三部分：高分子聚合物基质、电荷基团和平衡离子。离子交换剂对溶液中不同离子具有不同的结合力，这种结合力的大小与很多因素有关，包括离子交换剂的性质、离子本身的性质、离子强度、pH、温度、溶剂组成等等。结合力的大小通常由离子交换剂的选择性来衡量。 本实验利用超氧化物歧化酶的解离性质，在一定缓冲液条件下与离子交换纤维素吸附和解吸的能力不同于溶液中杂蛋白，进而除去杂蛋白，实验中选用DEAE离子交换纤维素。 [试剂和仪器] （1）试剂 ①DEAE ②缓冲液Ⅰ：2.5mmol/L