组织细胞提取RNA步骤方法所需材料及RT-PCR步骤.docVIP

RT-PCR步骤 Rt-PCR 一、 1、 :1ml、200μl、20μl、10μl、2μl 2、 1 ml、200μl、20μl 3、 5ml 4、 1ml吸头的一个，放置20μl吸头的一个 5、 EP1.5ml、200μl、100μl 6、 2个60ml的棕色试剂瓶（广口，带盖）、1个125ml的白色试剂瓶（放无水乙醇） 7、 50ml、250ml、500ml 8、 250ml、500ml、1000ml 9、 5ml、1.5ml、20μl 10、盐水瓶：250ml、500ml各两个备用，一个装无水乙醇，另一个装DEPC水 11、铝制饭盒：4个 12、塑料小饭盒：1个 13、大瓷缸：2个 14、锡箔纸：2卷 15、卷纸：2卷 16、三角烧瓶：带盖，稍大 二、实验器具的处理与准备 1、塑料制品：（包括枪头、EP管、匀浆管） 先将DEPC水从容量瓶中倒入瓷缸中，将塑料制品逐个浸泡其中，其中小枪头需要吸管打入DEPC水，过夜，然后高压，再烤干备用，实验前将枪头等放入吸头台，再高压一次（EP管） 2、玻璃制品：泡酸过夜，冲洗干净，蒙锡纸烤干备用（DEPC水泡）（洗净后先泡1‰DEPC过夜，再烤干） 3、匀浆器：（包括剪刀、镊子）先洗净后，再高压（不需要泡DEPC） 三、试剂配制 1、DEPC水：吸出1ml放在1000ml双蒸水中配成1‰DEPC水，放在1000ml容量瓶中静置4小时备用。 2、75%乙醇：用无水乙醇加DEPC水配，然后放-20℃保存（其中DEPC水需先高压） 3、异丙醇：放入棕色瓶中 4、氯仿：放入棕色瓶中 5、琼脂糖 四、几种缓冲液的配制 1、电泳缓冲液： Tris 54g 硼酸 27.5g 0.5M EDTA 20ml？PH：8.0 蒸馏水 1000ml  5×TBE （贮存液） 再将5×TBE稀释10倍成0.5TBE就可以在电泳时使用（即工作液浓度），如取50ml贮存液+450ml水-→500ml工作缓冲液 2、上样缓冲液： 0.25%溴酚蓝 0.25%二甲苯青FF 30%甘油 6×缓冲液，4℃保存 五、琼脂糖凝胶的配制： 1、1.0%： 1.0g琼脂糖+100ml电泳缓冲液，微波炉中火30秒至沸腾，熔化的琼脂糖冷却至60℃时加入10mg/ml溴化乙锭2.5μl，充分混匀，将温热的凝胶倒入已置好梳子的胶膜中，在室温下放置30-45min后现进行电泳。 2、1.5%： 同上，将琼脂糖的量改为1.5g 六、需购置的Rt-PCR材料： （生工. Tel.2236106） Taq酶（含MgCl2 buffer） 200μ 70.00 dNTP:一支 oligo（dT:）15：1OD 40.00 promega M-MLV：一支 250.00 promega（Buffer） RNasin:一支 110 -20℃ DEPC 5g 110.00 Trizol 100ml/瓶 Invitrogen Life technologies 4℃ Marker：10ug 0.2μg/ml 150.00 科威 （1543. 994. 697. 515. 377. 231） 七、引物合成 1、内参照: GAPDH 正义： 5′—ACCACAGTCCATGCCATCAC—3′ 反义： 5′—TCCACCACCCTGTTGCTGTA—3′ β-actin 正义：5′—CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC—3′ 反义：5′—TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT—3′ 2、par-4： 正义：5′—GGGACCTCGGAACTCAAC—3′ 反义：5′—TGTATCTGCCTGGGACTG—3′ 3、退火温度计算 2（A+T）+4（G+C） 正反义平均数，再上下波动度（±4℃，或±5℃） 4、引物各合成5OD，每OD一瓶分装好 5、引物稀释： 加DEPC水量为（μl） =？nmol/OD×管上所标OD数×100 是为10pmol/μl浓度的引物溶液 八、PCR产物电泳 先将1-10μl左右的PCR产物，加已点在纸上的溴酸蓝，反复吸打混匀后进行电泳，一般电流为10mA，电源100V，电泳30分钟，紫外灯下观察，满意的结果扫描打印。 九、几个注意点： 1、逆转录的关键步骤是立即冰水浴？ 2、Rt时，先打开PCR预热30分钟。 3、RNA抽提时，打开离心机预冷。 TRIzol法抽提总RNA 组织100mg ↓ 加1ml TRIzol ↓ 匀浆（要彻底，后转至EP管） （组织匀浆量＞100mg时分装1ml/每EP管） ↓ 颠倒混匀10下，室温5分钟 ↓ 4℃，离心12000g，15分钟 ↓ 转上层水相（约400μl）于另一1.5mlEP管中 ↓ 加等体积异丙醇（约400μl），混匀室温10分钟 ↓ 4℃，离心12000g，