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贴壁细胞培养克隆形成抑制试验原理：克隆形成实验是测定单个细胞增殖能力的有效方法之一，其基本原理是单个细胞在体外持续增殖6代以上，其后代所组成的细胞群体，成为克隆（集落），这时的每个克隆可含50个以上的细胞，大小在0.3-1.0 mm之间。通过克隆形成实验，可对单个细胞的增殖潜力做出作定量分析，了解细胞的增殖力和对生存环境的适应性。这种方法常用于抗癌药物敏感性实验、肿瘤放射生物学实验等。常见的有平板克隆形成实验和软琼脂克隆形成实验。本法适用于贴壁生长的细胞，包括培养的肿瘤细胞和正常细胞。材料与方法（一）用品：含15%新生牛血清的RPMI-1640培养液、含10%新生牛血清的RPMI-1640、培养液PBS、0.25%胰酶、细胞染色液（刘氏染液）、相机、12孔板、EP管。5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil, 5-FU）注射液（江苏南通精华制药有限公司），用无菌生理盐水配制成100 μg/ mL溶液，使用前稀释至所需浓度。（二）操作：制备细胞悬液：取对数生长期结肠癌SW620细胞，用0.25%胰酶消化并吹打成单个细胞，含10%血清的RPMI-1640培养液倍比稀释到所需的体积，使细胞密度为3×102个/mL，接种于12孔板，1000 μL/孔。PBS过一遍，加1ml消化液，弃消化液，10%培养液2ml冲洗细胞，再用枪吸出0.5ml至另一小瓶，3ml 10%培养液，混合（摇15次，吹15次），取100μl到EP管混合，取10μl细胞计数倍比稀释（吸出1ml，加2ml培养液。Mix。）吸出1ml，弃剩余液体，将1ml液体倒回小瓶，加2ml培养液。重复。直到需要的细胞数。12600个细胞/3ml，或8400个细胞/2ml。种板：12孔板，加0.9ml培液，加1ml细胞，不用摇。待细胞贴壁后加入药物，终体积为2000 μL，设6组0，0.33， 0.66 ，1.33 ，2.66， 3.99 4.66 μg/ml药物组，每组2复孔，转染后置37℃，5％CO2，饱和湿度条件培养箱内孵育7天。计数：满体积2000ul 其中药物浓度100ug/ml 100ulNS: 0 100 N=20.33 μg/ml *2000ul =100ug/ml * X X =6.6ul + NS 93.4ul N=20.66 μg/ml *2000ul =100ug/ml * X X =13.2ul + NS 86.8 ul N=21.33 μg/ml *2000ul =100ug/ml * X X = 26.6ul + NS 73.4ul N=22.66 μg/ml *2000ul = 100ug/ml * X X =53.2ul + NS 46.8 ul N=23.99 μg/ml *2000ul =100ug/ml * X X =79.8 ul + NS 20.2 ul N=1μg/ml *2000ul =100ug/ml * X X =93.2 ul + NS 6.8 ul N=1eg:5-FU 6.6 * 3 + NS 93.4 * 3 mix 在EP管中。等待加药。N=2吸去培养液，加入PBS洗涤后，染色,干燥：刘氏染色法　加Liu A Solution 0.5 ml染色30 s。　滴加Liu B Solution 1ml于A液上面,轻吹使其充分混合,染色1 min。水洗,干燥、拍照二、细胞传代原理：培养细胞生长一定时间后，需分离再培养，否则细胞因生存空间不够，细胞密度过大，致营养不足而引起细胞衰老、停止生长甚至死亡。为了维持细胞的存活和生长，必须进行再培养，即将原培养瓶内细胞分离、稀释、接种到新培养瓶内继续扩大培养。材料与方法（一）用品：含10%新生牛血清的RPMI-1640、培养液PBS、0.25%胰酶、EP管，细胞培养瓶。（二）操作：①制备细胞悬液：取对数生长期结肠癌SW620细胞，PBS过一遍，加1ml0.25%胰酶消化并吹打成单个细胞，弃消化液，10%培养液2ml冲洗细胞，再用枪吸出0.5ml至另一小瓶，3ml 10%培养液，混合（摇15次，吹15次），取100μl到EP管混合，取10μl细胞计数用。②细胞传代：在之前制备的细胞悬液2.5ml中，用滴管吸取1/3滴管至细胞培养瓶，后用滴管吸取3滴管含10%新生牛血清的RPMI-1640至细胞培养瓶，关紧瓶盖用酒精棉球搽拭后，放入37℃5%CO2培养箱中孵育。三、MTT比色法原理：MTT比色法是一种检测细胞存活和生长的方法。实验所用的显色剂是一种能接受氢原子的染料。化学名3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2,5-二苯基四氮唑溴盐。商品