第二章 基因操作中大分子分离与分析-08级.pptVIP

第二章基因操作中大分子的分离和分析;一、DNA的分离、检测和纯化;1、 DNA的组成和结构;B;form;DNA双螺旋结构模型;变性(denaturation）:指在温度、pH等因素作用下， DNA分子的氢键受到破坏，双链分开的过程。 复性（renaturation)：是变性的逆过程，DNA互补配对成为双链的过程。 带电性：一般pH下，带负电荷，可电泳分离。 水溶解性：DNA分子外形成水膜，可溶于水；但当电荷变化（如等电点）或水膜破坏时，就会沉淀，这是提取和分离DNA的依据。;3、染色体DNA的分离和纯化;材料准备： 使材料处于提取DNA得率最高的时期，选取最容易提取和含量最高的组织。 大肠杆菌：菌液培养至对数生长期后期 植物：幼嫩的植株或黄化幼苗 动物：肝脏应清除净胆囊;细胞裂解：关系到能否提取到DNA以及影响DNA得率高低和质量的关键步骤 细胞裂解缓冲液 100 mmol/L Tris-HCl, pH8.0 100 mmol/L EDTA 250 mmol/L NaCl 防止和抑制内源DNase对DNA的降解 ;分离和抽提DNA：根据待提取的DNA的性质，使其与细胞内的其他组分分离。 提取总DNA只须在细胞裂解液中加入适当的酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)或氯仿/异戊醇(24:1)等有机溶液，可使DNA与蛋白质分开。 用乙醇或异丙醇处理含DNA的水相，使其沉淀，离心获得DNA;4、大肠杆菌质粒DNA的分离和纯化;碱裂解法提取E.coli质粒DNA的原理 由Birnboim和Doly设计并于1979年发表。 在碱性条件下(pH12.0~12.5)线状DNA发生变性，质粒DNA维持环状。在高盐条件下作复性处理，变性的染色体DNA会形成沉淀，从而将质粒DNA与染色体DNA分开。;抽提/裂解缓冲液 溶液Ⅰ：灭菌后，4℃保存 50 mmol/L 葡萄糖 25 mmol/L Tris-Cl(pH8.0) 10 mmol/L EDTA(pH8.0) 溶液Ⅱ：现用现配，室温下使用(pH12.0~12.5) 0.2 mol/L NaOH 1% SDS 溶液Ⅲ：灭菌后，4℃保存，用时冰浴(pH4.6) 5mol/L乙酸钾 60ml 冰醋酸 11.5ml 水 28.5ml 溶液Ⅰ∶溶液Ⅱ∶溶液Ⅲ = 1 ∶2 ∶ 1.5;质粒DNA的纯化 用苯酚/氯仿抽提去蛋白质杂质 一般先按1:1（V:V）用苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)对DNA粗制品进行抽提，然后用1:1（V:V）氯仿/异戊醇(24:1)再次抽提 ，以除去蛋白质 用无水乙醇沉淀浓缩DNA 按2:1用无水乙醇（V:V）或1:1用异丙醇（V:V）在酸性条件下（加1/10 体积的 3M NaAc pH5.2）沉淀DNA。 用RNase去除RNA ;4、DNA的凝胶电泳 一定电场中，DNA分子的迁移率与所含碱基对数成反比。 琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖（agarose, 线性多糖聚合物） 凝胶缓冲液和电泳缓冲液(TBE, pH 8.3)： 45mmol/L Tris-硼酸 1 m mol/L EDTA 聚丙烯酰胺凝胶电泳 30%丙烯酰胺;Bio-Rab电泳仪电源;溴化乙锭(EB)能掺入到双链DNA中，在紫外光下会发出橙红色的荧光。 使用浓度：0.5μg/ml 紫外线波长： 254nm 302nm 366nm ;琼脂糖凝胶;影响DNA样品在电泳时泳动速率的因素 与DNA分子量对数成反比 DNA的构象：超螺旋＞线性＞开环形 SC构型：共价闭合环形DNA(cccDNA) OC构型：开环DNA(ocDNA) L构型：线性分子DNA(LDNA ) 与电流大小成正比 迁移率与凝胶浓度成反比 ;二、RNA的分离、检测和纯化;1、RNA的组成与结构特性;2、RN