汉坦病毒包膜糖蛋白糖基化位点突变体构建.docVIP

汉坦病毒包膜糖蛋白糖基化位点突变体的构建 【摘要】 目的 构建汉坦病毒糖基化位点的突变体。方法 利用基因定点突变的方法构建了5个糖蛋白突变体，即将G1、G2上的天冬酰胺置换为丙氨酸，根据被替换的位置，突变体分别命名为N134A、N235A、N347A、N399A、N928A。结果 构建的5个N-联糖基化位点的突变体，经测序图谱显示原序列中的天冬酰胺（N）均被置换为丙氨酸（A）。结论 成功构建了5个糖基化位点的突变体，为进一步研究N-联糖基化的缺失对细胞融合的影响奠定了基础。 【关键词】 汉坦病毒；糖基化位点；突变体构建 Abstract： Objective To construct N-linked glycosylation site mutants of hantavirus. Methods Site-directed mutagenesis was used to construct five glycoprotein gene mutants which were designed as N134A, N235A, N347A, N399A and N928A according to the substitution sites of asparagine with alanine on G1 and G2. Results Five N-linked glycosylation site mutants were constructed and their sequencing showed the asparagine (N) residues at the N-linked glycosylation sites on G1 and G2 were replaced by alanine (A). Conclusion N-linked glycosylation site mutants were successfully constructed and laid the foundation for study on the roles of N-linked glycosylation of HTNV glycoproteins in cell fusion. Key words: hantavirus; glycosylation site; construction of mutants 汉坦病毒(hantavirus，HV)是布尼亚病毒科(bunyaviridae)汉坦病毒属(genus hantavirus)的一员，是肾综合征出血热和汉坦病毒肺综合征的共同病原体。基因组为分节段的单股负链RNA，由长（L）、中（M）、短（S）3个基因片段组成，其中M片段编码的包膜糖蛋白G1、G2含有HV的主要生物学活性位点。 HV致病性取决于包膜糖蛋白的结构和功能，关键在于其与宿主细胞之间的相互作用，细胞融合则是病毒侵入细胞、复制、释放、传播、致病的重要生物过程，也是细胞间信息传递的重要步骤。而糖基化不仅在蛋白的正确折叠和胞内运输中起着重要作用，对细胞融合也有重要影响。 HV G1和G2糖蛋白上分别有5个和1个位点可提供N-联糖基化［1］。各糖基化位点对蛋白折叠和胞内转运的影响力不同，N134位点的糖基化对糖蛋白正确的折叠非常关键，而其他位点突变以后对糖蛋白折叠影响不大。为了解各糖基化位点对细胞融合的影响，利用基因定点突变技术构建了5个N-联糖基化位点的突变体，为进一步研究各糖基化位点的改变在细胞融合中所起的作用奠定基础。 1 材料和方法 1.1 材料 1.1.1 质粒与菌株 质粒pMD18-T10.1和pMD18-T10.2由山东省疾病预防控制中心陶泽新博士构建并保存。大肠杆菌DH5 菌株用LB培养基培养，本室保存。 1.1.2 试剂 质粒提取试剂盒购于美国Omega公司，PCR材料、各种内切酶购于大连宝生物（TaKaRa）工程有限公司，琼脂糖凝胶电泳材料购自美国Sigma公司，测序由北京博尚生物技术有限公司完成。 1.2 方法 1.2.1 碱裂解法提取质粒pMD18-T10.1和pMD18-T10.2 过夜培养分别含有G1、G2基因的质粒pMD18-T10.1和pMD18-T10.2，利用E.Z.N.A. Plasmid Mini Kit I质粒抽提试剂盒分别抽提2种质粒。 1.2.2 单酶切反应 将质粒pMD18-T10.1和pMD18-T10.2分别用PstⅠ和KpnⅠ单酶切，命名为E1、E2、E3、E4。 1.2.3 PCR扩增所需片断 以E1、E2、E3、E4作为模板进行PCR扩增。目的是将G1、G2糖基化位点上的天冬酰胺置换为丙氨酸。引物设计如下：N134AP1 up：5′-TCTAGCCTG