实验五大鼠肝s9的制备和蛋白含量测定.doc

院系：理学院 专业：农药学 学号：09310110020 姓名：王熠 大鼠肝S9的制备和蛋白含量测定 1 实验目的 学会大鼠肝S9的制备及其蛋白含量的测定。 2 实验材料与方法 2.1实验动物 大鼠：健康、雄性、成年，SD或Wistar ，5~6 周 龄，150g左右 2.2试剂 1.17% （0.15M） KCl、苯巴比妥钠、戊巴比妥钠、多氯联苯、β-萘黄酮 Tris-HCl缓冲液：6.05g Tris加约800ml蒸馏水溶解，用HCl溶液调pH值至7.4，最后用蒸馏水定容至1000ml 2.3器材 低温高速离心机、洁净工作台、匀浆器、注射器、手术剪、低温冰箱、液氮罐等 2.4 实验操作 2.4.1试剂的配制 （1）Tris-HCl缓冲液：6.05g Tris加约80ml蒸馏水溶解，用HCl溶液调pH值至7.4，最后用蒸馏水定容至1000ml （2）考马斯亮兰G-250染料：称100mg考马斯亮兰G-250，溶于50ml 95％的乙醇后，再加入120ml 85％的磷酸，用蒸馏水稀释至1升，滤纸过滤。 2.4.2肝S9的制备 （1）诱导 苯巴比妥钠80mg/kg， 腹腔注射，连续3～5d，最后一次给药后24h后采样。 （2）采样 采样前禁食24h，但可以自由饮水；断头处死；无菌取出肝脏，置平皿中称重，用预冷的0.15M KCl溶液淋洗数次，以便除去能抑制微粒体酶活性的血红蛋白。 （3）肝匀浆的制备 弃去淋洗液，将肝脏转入小烧杯，加 Tris-HCl缓冲液溶液 3mL/g （肝湿重），转入冰浴，用剪刀剪碎肝脏，转入匀浆器匀浆。 （4）制备S9 将肝匀浆于低温高速离心机0～4℃ 000g 离心 10min上清液即为S9。 （5）分装保存 将制备好的S9于无菌冷冻管或安瓿中保存，每个安瓿2mL左右。于液氮速冻后置-80℃低温保存。深低温或冰冻干燥，保存期不超过一年。 2.5蛋白含量测定（考马斯亮兰染色法） 2.5.1测定原理 考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质（主要是碱性氨基酸，特别是精氨酸和芳香族氨基酸残基）结合，使染料的最大吸收峰的位置，由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为蓝色。染料在595nm下测定的吸光度值与蛋白质浓度成正比。 2.5.2特点 （1）灵敏度高，比Lowry法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达0.5 (g （2）测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。 （3）干扰物质少。如干扰Lowry法的K+、Na+、Mg2+离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。 2.5.3试剂与器材 试剂： 标准蛋白质溶液：1mg/ml牛血清清蛋白（BSA） 考马斯亮兰G-250染料试剂：称100mg考马斯亮兰G-250，溶于50ml 95％的乙醇后，再加入120ml 85％的磷酸，用蒸馏水稀释至1升，滤纸过滤。 Tris-HCl缓冲液： 6.05g Tris加约80ml蒸馏水溶解，用HCl溶液调pH值至7.4，最后用蒸馏水定容至1000ml（0.05M） 2.5.4操作方法 微量法制定标准曲线 按下表加样，混匀，室温静置5-10min，以0号试管为空白对照，于595nm处比色测定吸光度，平行测定三次。95nm处吸光度为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，在坐标纸上绘制标准曲线。 表一：测定标准曲线的试样 样品编号 0 1 2 3 4 5 6 标准血清溶液（ug） 标准血清溶液（ml） 蒸馏水（ml） 0 0 0.1 10 0.01 0.09 20 0.02 0.08 40 0.04 0.06 60 0.06 0.04 80 0.08 0.02 90 0.1 0 考马斯亮兰试剂（ml） 5.0 肝S9蛋白质浓度的测定 测定方法同上，分别取肝S9组分10倍稀释液20(L、30(L、40(L，按下表加样，测595nm的吸光度值，平行测定三次。根据所测定的平均值，在标准曲线上查出其相当于标准蛋白的量，从而计算出未知样品的蛋白质浓度(mg/mL)。 表二：待测蛋白的试样 样品编号 0 1 2 3 上清液（ml） 蒸馏水（ml） 0 0.1 0.02 0.08 0.03 0.07 0.04 0.06 考马斯亮兰试剂（ml） 5.0 3 实验结果 表三：准曲线管的吸光度值 试样 1 2 3 4 5 6 一 0.012 0.08