第十章蛋白类药物生产.docVIP

第十章 蛋白类药物白质类药物主要蛋白质类药物的制备蛋白质药物包括蛋白质类激素、蛋白质细胞生长调节因子、血浆蛋白质类、黏蛋白、胶原蛋白及蛋白酶抑制剂等，其作用方式对机体各系统和细胞生长的调节、被动免疫、替代疗法等。其他蛋白质激素垂体蛋白质激素 生长素(GH)、催乳激素(PR)、促甲状腺素(TSH)、促卵泡激素(FSH)等促性腺激素人绒毛膜促性腺激素(HCG)、血清促性腺激素( SGH )等。其他蛋白质激素胰岛素、胰抗脂肝素、尿抑胃素等。人生长素（human growth hormone，hGH）191个氨基酸，分子量为200，等电点4.9，沉降系数S20，W 2.179，其活性不需要整个分子结构，N端1～其化学结构与催乳素近似，故生长素有弱催乳素作用，而催乳素有弱生长素作用。生长素不同种类动物的生长素，其化学结构与免疫性质等有较大差别 传统的工艺过程 ① 材料获取 处死动物立即取脑垂体，② 预处理 脑垂体用蒸馏水洗数次，剥离前后叶③ 匀浆 取动物垂体前叶，加水硫酸铵pH至5.5，置组织捣碎机中匀浆④提取匀浆以水抽提，10 000离心30min取沉淀pH 4.0的0.1mol／L硫酸铵溶液抽提，离心同上取沉淀再用pH 55的0.25mol／L硫酸铵溶液抽提，离心，抽提液⑤沉淀 抽提液pH5，加饱和硫酸铵溶液至硫酸铵浓度为lmol／L，离心⑥再沉淀加饱和硫酸铵溶液至1.8mol／L，离心得沉淀⑦除盐 将沉淀溶于少量蒸馏水中，对蒸馏水进行透析，得透析内液⑧等电点沉淀 将所得透析内液用或NaOH分别依次于pH 40和pH 49进行等电点沉淀，离心取上清液盐析 上清液pH4.0，加饱和硫酸铵溶液至1.25mol／L盐析离心，得沉淀物将沉淀物溶于少量蒸馏水中，对含01mol／L氯化钠的ris-HCL (pH 8.5) 缓冲溶液进行透析得透析内液凝胶过滤 透析内液上Sephades G-75凝胶柱用含01 mol／L氯化钠的50mmol／Lris-HCL (pH 8.5 )缓冲溶液进行洗脱，分步收集，活性GH存在于第Ⅱ峰中透析将活性峰部分对65mmol／L的硼砂盐酸(pH 87)缓冲溶液进行透析得透析内液层析 将透析内液上DEAE-C(DE-52)柱，用含0～03mol／L氯化钠的65mmol／L硼砂盐酸 ( pH) 缓冲溶液进行梯度洗脱，合并活性峰，脱盐，冻干得GH。hGH的种属特异性很强，动物生长激素不能用于人，hGH的惟一来源是从人尸体的脑垂体中取得。hGH，美国的Genentech公司hGH产量高达1.5g/L，这也是第一代重组人生长激素，商品名称为Prtropin. 生产路线如图11-2所示。 （1）工艺过程如下： ① 工程菌的构建　利用基因工程技术构建高效分泌型基因工程菌株，在生长激素的N-端增加分泌信号肽序列，使表达合成的重组人生长激素结构和天然人生长激素完全一致。 ② 菌种繁殖　采用M9培养基，添加CAA(酪蛋白氨基酸)，调节pH 至7．0，置于摇床上，30℃，进行菌种培养繁殖。 ③发酵 培养基同菌种繁殖培养基，种子培养过夜，开始进行发酵，时间一般为16~18h，温度为37℃，pH7.0~7.5，溶解氧不能低于20%。 ④补料发酵 在发酵进行5~7 h后，需要适量补充葡萄糖、酵母浸出物、氮源、CAA、无机盐和微量无素，如PO43-、Fe2- 、Co2- 等离子，通过添加补料，可使菌体生长的对数期延，发酵菌体产量增加了一倍。其余的发酵条件与上述条件相同，菌体生长至稳定期放罐。。 ⑤离心　将发酵菌体进行冻融破碎，按一定比例，加入预冷的由10 mmol/L Tris和1mmol/L EDTA组成的缓冲溶液（pH 7.5），80rpm搅拌1h，离心，收集上清液。 ⑥粗提 在上清液中加入硫酸铵至饱和浓度45%，4℃放置2h，10000rpm离心30min，收集沉淀。 ⑦脱盐　沉淀用10 mmol/L Tris和1mmol/LEDTA组成的pH值为8.0的缓冲溶液溶解，用Sephadex -G25脱盐。 ⑧纯化　采用Phenyl-Sepharose，DEAE-Sepharose进行色谱，再加入固体硫酸铵达到饱和浓度45%，沉淀2h，离心，收集沉淀，溶解沉淀，再通过sephacryl S-11HR及DEAE-Sepharose进行纯化，得到人生长激素原料药半成品.。 （2）质量检验：质量必须符合中华人民共和国药典2005年版二部附录规定。 目前人和动物生长素基因都已在大肠杆菌中表达成功，( insulin ) 胰岛素广泛存在于人和动物的胰脏中，正常人的胰脏约含有200万个胰岛，占胰脏总质量的15％。胰岛由和三种细胞组成，其中细胞制造胰高血糖素和胰抗脂肝素，细胞制造胰岛素，细胞制造生长激素抑制因子。胰岛素在细胞中开