转化生长因子β1（TGF-β1）对胃癌细胞microRNA表达谱的影响.pdfVIP

16 复旦学报 (医学版) 2013年 1月 ，40(I) 在我国，胃癌的发生率和死亡率居恶性肿瘤之 Trizol法提取各组 胃癌细胞的总RNA。用紫外分 首 ，浸润和转移是导致死亡的主要因素。探讨 胃癌 光光度计测 定总 RNA样 品在波长 26()nm及 280 浸润转移的机制具有十分重要的现实意义。TGF-~1 nm处吸光度 的比值 (D： ／D：)来确定其纯度和浓 是转化生长 因子 B(transforminggrowthfactorp， 度 ，确保 比值为 1．8～2．1。变性凝胶电泳分析提取 TGF~)超家族成员之一 ，其含量在这个家族中最高 ， 的总 RNA的完整性 ，观察 28S、18S、5S条带 的宽 具有代表性 。TGF-t31由2条均有 112个氨基酸的 度和亮度，以判断 RNA有无降解 。 相同多肽链经二硫键相连的二聚体组成，相对分子质 miRNA表达谱芯片检测 本实验采用美 国昂 量 (Mr)为25000，基因定位于染色体 19@3．1。大量 飞 (Affymetrix)公司的GeneChipmicroRNA芯片， 研究表明TGF-~1能够促进 胃癌的浸润和转移_l3j，其 由北京博奥生物有限公司完成检测 。miRNA 探针 表达程度与 胃癌的浸润深度和淋 巴结转移、复发呈正 序列信息来 自于 SangermiRBasemiRNAdatabase 相关，与预后呈 负相关 I5]，但其机制 尚不清楚。 V11(http：／／microrna．sanger．uk)，针对每个人 的 miRNA(microRNA)作为生物体重要 的基 因调控分 miRNA设计 了847个探针，每个探针重复4次。向 子，其表达失控可能会导致肿瘤的发生并影响肿瘤的 1 g总RNA样 品力Ⅱ入 500 I1mmol／ITrisCI 进展。在弥漫性大 B细胞淋巴瘤 (diffuselargeBcell 和 1 LATPmix，}昆匀，定容至 8 I。加入 2 I lymphoma，DLBCL)中，被 TGF-131磷酸化的 Smad5 RNASpikeControlOligos，得至010 LRNA／Spike 是 miR-155的直接作用靶点 ]。TGF-~1能够上调 Control混合物 。向混合物 中加入 5 Ipoly(A) miR-181b的表达，促进肝癌的发生_l7j。越来越多的 TailingMix，将 poly(A)尾 巴连接至小 RNA 3端 ， 研究表 明TGF-~I1与 miRNAs相互影 响、共 同致 得到 15 L混 合物 ，再 将 4 I 5×FlashTag 病 ”]。但是，TGF-~1对 胃癌细胞 miRNA的调控 LigationMixBiotin和 2 IT4DNA Ligase加入 作用国内外尚未见文献报道。 上述 15 L反应 体系 中得到 21 I}昆合物 ，将 本研究利用 miRNA芯片技术 ，检测 TGFj31 miRNA进行生物素荧光标记 。混合物25o(、温浴 3() 作用后 胃癌细胞 miRNA 的差异表达 ，对其结果进 min，加 2．5 L停止液终止反应 ，获得标记好 的 行初步分析，从 miRNAs水平探讨 TGF—B1促进 胃 miRNA 体 系。将 芯 片 平 衡 放 置 于 杂 交 炉 癌细胞浸润转移的分子机制 ，为胃癌的临床靶 向治 (HybridizationOven640)中，48℃、60r／min旋 转 疗提供可靠 的实验依据。 16h，进行杂交反应。杂交完成后，清洗、染色和扫 描 (Scanner3000)，采集并将其进行数字化转换 。 材 料 和 方 法 芯片数据处理及统计分析 使用 GeneChip@