细胞内特异核酸序列定位与定性.ppt

科学研究的一般流程 第三章 细胞生物学研究方法 ?细胞形态结构的观察方法 ?细胞组分的分析方法 ?细胞培养、细胞工程与显微操作技术 第一节 细胞形态结构的观察方法 ?光学显微镜技术（light microscopy） ?电子显微镜技术 (Electro microscopy) ?扫描遂道显微镜 (scanning tunneling microscope ) 1 光学显微镜技术 1.1 普通复式光学显微镜技术 普通光学显微镜的基本结构 普通光学显微镜样品制备 ★样品的固定(fixation)：甲醛或戊二醛 ★包埋和切片(embedding and sectioning)：液态的石蜡或树脂 ★染色(staining)：苏木精( hematoxylin)对负电荷分子有亲和性，能显示出细胞内核酸的分布；酸性染料如伊红( eosin)可使细胞质染色；苏丹染料( Sudan dyes)在脂肪中的溶解度比在乙醇中大，所以苏丹染料的乙醇饱和溶液能使脂肪着色。 1.2 荧光显微镜技术（Fluorescence Microscopy） 标记荧光素在激发光下以荧光成像。在光镜水平用于特异蛋白质等生物大分子的定性定位。如绿色荧光蛋白(GFP)的应用 ?直接荧光标记技术 ?间接免疫荧光标记技术 1.3 激光共焦扫描显微镜技术（Laser Scanning Confocal Microscopy） 物镜和聚光镜同时聚焦到同一个小点，排除焦平面以外光的干扰，只有焦平面的光成像，增强图像反差和提高分辨率1.4—1.7倍，图像更清晰。可重构样品的三维结构。 1.4 相差和微分干涉显微镜技术 利用一块“相差板”，将光程差或相位差转换成振幅差，偏振光经合成后，使样品中厚度上的微小区别转化明暗区别，增加了样品反差，且具有立体感，不用染色即可用于观察活细胞，也适于研究活细胞中较大的细胞器等颗粒。 ?JEOL-100型透射电子显微镜 Hitachi-450型扫描电子显微镜 ?电镜与光镜的比较 2.2 主要电镜制样技术 ? 超薄切片技术 如同光学显微镜，电子显微镜的样品也需固定、包埋、切片、染色等。见P59 ?负染色技术 一些生物大分子组成的结构，如病毒、线粒体基粒、核糖体和蛋白质组成的纤维等可以通过负染色电镜技术观察其精细结构。 用重金属盐(如磷钨酸钠、醋酸铀等)对铺展在载网上的样品进行染色，使整个载网都铺上一层重金属盐，而有凸出颗粒的地方则没有染料沉积。由于电子密度高的重金属盐包埋了样品中低电子密度的背景，增强了背景散射电子的能力以提高反差，这样，在图像中背景是黑暗的，而未被包埋的样品颗粒则透明光亮，这种染色称为负染技术。负染色是只染背景而不染样品，与光学显微镜样品的染色正好相反。 ?冰冻蚀刻技术 冰冻断裂与蚀刻复型，即用铂、金、碳喷涂断面，获得样品模具而观察。主要用来观察膜断裂面的蛋白质颗粒和膜表面结构等。见P61 ?电镜三维重构技术 电镜三维重构技术是电子显微术、电子衍射与计算机图象处理相结合而形成的具有重要应用前景的一门新技术。 电镜三维重构技术与X-射线晶体衍射技术及核磁共振分析技术相结合，是当前结构生物学（Structural Biology）——主要研究生物大分子空间结构及其相互关系的主要实验手段。 ?扫描电镜技术 样品在观察前，要在表面喷涂一层金膜，由电子“探针”扫描，激发样品表面放出二次电子，探测器收集二次电子成象，反映样品表面的形貌特征。 3 扫描遂道显微镜 (80年代发展起来的检测样品微观结构的仪器) 包括：STM、AFM、磁力显微镜、摩擦力显微镜等 原理：扫描探针与样品接触或达到很近距离时，即产生彼此间相互作用力，如量子力学中的隧道效应（隧道电流）、原子间作用力、磁力、摩擦力等，并在计算机显示出来，从而反映出样品表面形貌信息、电特性或磁特性等。 ?装置：扫描的压电陶瓷，逼近装置，电子学反馈控制系统和数据采集、处理、显示系统。 ?特点：（1）可对晶体或非晶体成像，无需复杂计算，且分辨本领高。（侧分辨率为0.1～0.2nm，纵分辨率可达0.01nm）； （2）可实时得到样品表面三维图象，可测量厚度信息； （3）可在真空、大气、液体等多种条件下工作；非破坏性测量。 （4）可连续成像，进行动态观察 ?用途：纳米生物学研究领域中的重要工具,在原子水平上揭示样本表面的结构。 第二节 细胞组分的分析方法 超离心分离细胞器与生物大分子 层析分离技术 生物大分子显示方法 特异蛋白抗原的