磷酸化蛋白质组学数据库及应用工具六-生命奥秘.pdfVIP

生生命命奥奥秘秘wwwwww..lliiffeeoommiiccss..ccoomm 3.3.2 同位素代谢标记技术 15 15 N标记法 （N labeling ）是Oda等人最早提出的一种同位素代谢标记技术，它是在培养基中分别掺入 14 15 N和 N来寻找差异表达蛋白的一种方法。虽然该方法非常适用于追踪单个磷酸化位点的动力学变化，但它 仅限于分析那些表达水平相对较高的蛋白质。SILAC （stable isotope labeling by amino acid in cellculture ） [25] 15 技术 出现以后，很快取代了 N标记法。SILAC技术，即细胞培养过程中氨基酸的稳定同位素标记，具有显 著的优点 （表2 ），因而迅速获得认可并在国际著名实验室中广泛使用。已经使用过的稳定同位素标记氨基酸 有精氨酸 （Arg ）、赖氨酸 （Lys ）、酪氨酸 （Tyr ）和亮氨酸 （Leu ）等。 表2 SILAC标记技术具有以下显著优点 蛋白质损失小； 标记效率高、误差低； 可以实现多种样本比较； 肽段覆盖率高，可以提高定量结果和鉴定结果的可靠性； 实验操作简便。 3.3.3 18O标记技术 18 18 18 O标记技术是将蛋白质酶切时或酶切后放入H2 O 中，在蛋白酶催化作用下将羧基上的两个氧替换成 O 18 而进行的。除了C端肽之外，在适宜的条件下，所有的肽段一般都可以替换上两个 O ，使肽段质量数相差4 [29] 18 u 。Korbel等人 采取免疫沉淀反应/ IDE/ LC/ MS与 O标记来分析EPO受体依赖的蛋白质，鉴定并定量了187 18 个磷酸化蛋白，发现89个蛋白质上的酪氨酸以EPO受体依赖的方式发生变化。 O标记技术是一种操作简单、 条件温和、应用广泛 （trypsin、chymotrypsin、lys-C和glu-C都能被用来标记酶切肽段的C端），并且没有副 18 产物的标记技术。它能与多种磷酸化肽段富集方法连用，适于低丰度磷酸化肽段的定量标记。目前， O标记 18 技术已得到国际上一些大型实验室的青睐。但是，用 O进行同位素标记经常产生标记一个氧原子和两个氧原 18 16 子不等的现象，即产生分子质量+2和+4两种混合的产物。此外， O与 O交换速率也依肽段的大小、氨基酸 的类型、酶的类型以及肽段序列而有所变化。所以，尽管该技术已经得到比较普遍的应用，但是要得到准确 的定量结果还需对其进一步优化。 六、磷酸化蛋白质组学数据库及应用工具 表3~表7列出了部分磷酸化蛋白质组学数据库及应用工具的名称、网址及其特征。 表3 磷酸化数据库