试验微藻原生质体的分离.PPT

实验一、微藻原生质体的分离 实验目的 1. 了解微藻原生质体分离的原理、方法与技术； 2. 熟练、掌握原生质体分离的基本操作过程。 实验原理 根据藻类细胞脱壁程度的不同，Adamich将脱壁后的藻细胞定义为原生质体（protoplast）和原生质球（spheroplast）。原生质体是指任何基因型的藻细胞其质膜外的细胞壁和包被层被全部除去而保持其余细胞组分的部分；原生质球是任何基因型的藻细胞其细胞壁被全部或部分除去，仍保留质膜外包被层的含全部细胞内组分的部分。 海洋微藻因其细胞壁组成的明显差异，原生质体的分离方法很多，例如蓝绿藻的细胞壁含有粘肽，因而可以用溶菌酶处理获得蓝绿藻细胞的原生质体。绿藻的细胞壁主要成分是纤维素，所以可以用纤维素酶处理而获得原生质体或原生质球。硅藻和甲藻因其特殊的细胞壁组成和结构，可用去污剂或富含有机物但缺乏二价阳离子的溶液处理而达到分离原生质体的目的。红藻和褐藻则可用多糖酶消化细胞壁成分来制备原生质体。尽管有这样多的方法，但目前普遍采用的方法是酶解的方法。 仪器与试剂 1、仪器 ①恒温水浴；②低速离心机；③冷冻离心机；④离心管40-50ml;⑤三角烧瓶；⑥显微镜，荧光显微镜。 2、试剂与酶 ①酶：纤维素酶（Onozuka R-10）,离析酶；②浸透压调节剂：甘露醇、山梨醇和Nacl；③密度勾配剂Ficoll和蔗糖。 实验步骤 1、藻株的培养； 2、原生质体的分离； （1）取对数期的培养藻细胞（浓度为5×107细胞/ml）10ml离心沉淀（1000×g,5min,室温）。 （2）用加入0.85mol/LNaCl的MBM液洗沉淀的藻细胞一次（1000×g,5min）。在相同的MBM液中加入1%纤维素酶和0.5%的离析酶。将洗好沉淀的细胞在10ml上述加酶的培养液中悬浮。 （3）在振荡器上缓慢振荡（20-30次/min）细胞悬浮液，30℃保温，1000-2000lx光照。 （4）在定时取出1ml处理样品，离心分离（1000×g,5min），用MBM液（含0.6mol/l山梨醇）洗涤一次，离心沉淀后，用MBM液（含0.6mol/l山梨醇）重新悬浮。 （5）取0.1ml上述悬浮液再悬浮到0.9ml蒸馏水中，显微镜下观察悬浮液中的细胞。原生质体化的细胞膨胀变大、破裂，可见内容物漏出。 （6）80%以上细胞原生质体化后（1-2h）,将细胞悬浮液置于离心管中配制好的Ficoll不连续密度离心介质（10%-25%）的顶部，10000r/min离心30min。 （7）在15%-20%界面处回收原生质体，用MBM（含0.6mol/l山梨醇）液洗涤原生质体。 作 业 1、影响微藻原生质体分离效果的因素有哪些？ 2、原生质体和原生质体球之间有何差异？ 实验二、原生质体培养 实验目的 1、学习掌握原生质体培养培养基的种类以及配制方法； 2、熟练掌握原生质体培养的基本过程与技术要领。 实验原理 分离得到的原生质体如培养在合适的培养基和培养条件下，细胞壁可以再生，细胞可以增殖。原生质体再生的能力与原生质体化程度和酶处理时间呈反比关系。 仪器与试剂 1、仪器 ①灭菌培养皿；②血球计数板，显微镜等；③试管（12ml的一次性使用塑料试管）。 2、培养基 液体再生培养基：MBM加浸透压调节剂（20%蔗糖或0.6mol/L山梨醇），高压灭菌。 琼脂再生培养基：MBM加浸透压调节剂（20%蔗糖或0.6mol/L山梨醇）加1.5%琼脂。 实验步骤 1、分离制备的C.ellipsoidea C-87原生质体（Ficoll中），用两倍体积的液体再生培养基稀释； 2、离心沉淀原生质体（1000×g,5min），弃去上清液，用液体再生培养基再洗涤一次； 3、用相同的培养基将原生质体重新悬浮。用血球计数板计数，使细胞密度达到5×107个/ml； 4、于25℃和光照3000lx条件下静置培养3d，然后取出合适密度（104个细胞/平板）原生质体与已冷却但尚未凝固的琼脂培养基（0.6%琼脂）混匀后，倒入培养皿使原生质体在平板上增殖； 5、再生平板培养基增殖，此阶段细胞壁再生能力很强，如将培养基的糖浓度降低50%，可加快增殖速度； 6、25℃光照下（6000lx）静置培养，1-2周后，出现藻落。 注意事项 通常1-2周后，再生率达10%（好的可达30%），这时可以从琼脂培养基上看到藻落出现。在没有渗透压调节剂的平板上，如果有藻落出现，则可能产生于自生孢子。用软琼脂培养基（0.6%琼脂）包埋原生质体的方法培养，再生频率高但藻落出现晚。液体再生培养基静置培养的原生质体，2-3d细胞壁即可再