中孕血清hAFPFreehCGβ测定操作程序.docVIP

中孕血清测定操作程序 （DELFIA法） XXXXXXXXXX产前诊断中心 操作规程文件号： 第 版 共 页 年 月 日起实施 本规程每 年复审一次 复审日期： 年 月 日 复审人： 规程编写者： 审批者： 批准日期： 文件分发部门和/或个人： 医务科；保管者： 院长办公室；保管者： 院档案室；保管者： 产前诊断中心；主任： 原理 甲胎蛋白（hAFP）是胎儿起源的糖蛋白。它先由胚胎卵黄囊细胞合成，随后在胎儿肝脏中合成：它经由羊膜扩散到母亲血液中并通过胎儿的尿到达羊水。羊水和母本血清中的hAFP水平的升高与胎儿畸形发育，尤其是神经管畸形相关。另外还发现在怀有唐氏综合症患儿的母亲的血清中，hAFP在孕中期含量平均减少了30%。 绒毛膜促性腺素（hCG）是含α和β两个亚基的糖蛋白。两个亚基既可以非共价结合形成一个完整的hCG，也可以游离存在于血清中。hCG在怀孕后6至8天内出现在血清中，并在最后一次月经之后50至80天内达到最大值。β亚基是成簇的6个基因编码，但其中仅有两个在胎盘中得到转录和表达。另外发现，如果胎儿患有唐氏综合症，则孕中期母体血清中hCG的游离β亚基水平会在怀孕中期增长超过100%。 对母体血清中，hAFP和游离hCGβ的测定有助于诊断胎儿畸形发育，诸如神经管缺陷和唐氏综合症。研究表明，利用母亲年龄和妊娠第二阶段年龄化的hAFP和游离hCGβ含量的这两项指标，是产前筛查唐氏综合症的有效方法。 本实验是一种固相、2位点荧光免疫测试法，它采用直接“三明治”夹心法，通过单克隆抗体（鼠抗体）对人甲胎蛋白分子的两个独立抗原决定子进行检测，通过相同的方法，使用两个单克隆抗体（鼠抗体）可以检测游离hCGβ。标准品、质控品、孕母的样本血清中所包含的人甲胎蛋白与hCGβ同时与固定的hAFP及hCGβ特异性单克隆抗体反应。同时，hAFP与铕（Eu）标记的单克隆抗体起反应，hCGβ与钐（Sm）标记的单克隆抗体起反应。标记的抗体直接针对于不同的特定抗原位点，而不是固定的抗体。因此，仅需要一次孵化。 增强液将Eu 和Sm从标记抗体分离至溶液中，从而与增强液中的成分生成高荧光强度螯合物。测定它们的荧光强度，每个样本的Eu和Sm的荧光强度分别与样品中的hAFP和游离hCGβ含量成正比例关系。 本操作规程为使用Perkin Elmer公司Victor2D测定仪及其公司提供的配套试剂盒（A067-101）进行血清hAFP和游离hCGβ测定。 标本要求 为孕14—20周孕妇血清2ml，制备时未与抗凝剂接触，非水浴，需自然固缩离心而成。 试剂 每个DELFIA hAFP和游离hCGβ试剂盒内装有96次测定用试剂，整套包装的试剂盒的有效期见外部标签，需贮存在+2～+8℃。每个试剂盒包括： 1）标准品：6小瓶，冻干粉，hAFP浓度依次为0，1，5，25，125，500 U/ml血清浓度，hCGβ浓度依次为0，2，5，20，100，200 ng/ml血清浓度，不同批号试剂盒浓度会有稍微改变，确切浓度在试剂盒附带的质量控制证书上标注。 2）抗- hAFP -铕示踪剂贮存液（鼠单克隆）：0.75ml/瓶，1瓶。 3）抗-hCGβ-钐示踪剂贮存液（鼠单克隆）：0.75ml/瓶，1瓶。 4）DELFIA-2缓冲液：30ml/瓶，1瓶，红色。 5）浓缩洗液：40ml/瓶，1瓶。 6）增强液：50ml/瓶，1瓶。 7）微孔板条：96孔板（8*12孔），1板。涂有抗hAFP和hCGβ（鼠单克隆）的抗体。 8）试剂盒批号匹配的质量控制证书：1张 9）可多次密封储藏微孔板条的塑料袋：1个 仪器与设备 1）时间分辨荧光免疫测定仪（Victor2D 1420）：配有电脑程序，直接将每秒钟荧光脉冲数换算成hAFP和游离hCGβ浓度 2）自动振荡器：Delfia Plateshake 1296-003 3）自动洗板机：Delfia Platewash 1296-026 4）连续加样器：Eppendorf Multipette 多通道移液器 操作步骤：（见附1） 1）将试剂盒置室温半小时，恢复至室温（+20～+25℃）。 2）hAFP和游离hCGβ标准品复溶：将1.1ml蒸馏试剂水加入每个小瓶中，轻摇混匀。在使用前静置30分钟以上，避免产生泡沫。 3）抗-hAFP-Eu/hCGβ-Sm标记液体的配置：将标记浓缩液和DELFIA-2缓冲液混合，得到所需体积的标记液，（在使用前一小时内准备）配置后应尽快使用。请注意DELFIA-2缓冲液不能碰到剩下的下一次使用的标记浓缩液。 4）在板条架上放置所需的微孔板条 5）按顺序在每个微孔中加入200ul标记溶液，25ul标准品、25u