抗坏血酸的活性抑制基因细胞周期进程必要性的影响外文翻译.doc

抗坏血酸的活性抑制基因细胞周期进程必要性的影响 引言 很长一段时间，抗坏血酸（ AA ）被描述Mm HEPES，配成浓度为50mg/ml。 RNA的提取与分析 潜伏期后，提取总的RNA，利用TRIZOL（Invitrogen公司）按照制造商的要求从细胞中提取总的RNA。为确保使用前RNA的完整性，使用Agilent 2100 Bioanalyzer测试每个样品的质量和浓度。 杂交和基因芯片扫描 以下材料是从安捷伦公司购买的：低投入的RNA荧光线性扩增试剂盒，ITU杂交试剂盒，60-mer oligomicroarray 套件。反转录反应和杂交ssentially 遵循议定书中所建议的安捷伦4.1版本。 简言之，每个500纳克样品总RNA逆转录成cDNA需要使用寡核苷酸引物。反应可以在40℃含有500mM dNTP 和400U核苷酸的溶剂中进行2小时完成反转录。然后在65uC进行15分钟，潜伏期终止。包含400mM箐-5氨甲酰蛋白（Cy3的未经处理的样品）或400mM箐-5氨甲酰蛋白（Cy5的处理样品）的转录组合，和T7RNA聚合酶的混合液中反应2小时。根据制造商的协议用试剂自旋盒纯化cDNA 基因样本。在含有750毫微克的Cy3和Cy5标记的cDNA 探针的440毫升的混合液中进行杂交。控制目标，然后按照制造商的要求洗芯片，干燥，使用安捷伦芯片扫描仪进行扫描，在532纳米处测量Cy3和635纳米处测量Cy5。使用Luminator 生物信息学平台进行结果分析。结果存入MIAMExpress数据基地。 逆转录—PCR分析 为了证实在微阵列观察到的基因表达形式，我们根据AA治疗对每个逆转录的PCR进行定量来核实基因表达水平。其中使用带有（罗氏）普遍探针库（统一价目表）的轻循环480实时PCR系统对PCR定量。取每个标本的总量RNA中的2微克采用SuperscriptⅡ逆转录酶进行逆转录生成cDNA。人B-肌动蛋白和人的18s核糖体DNA用于数据正常化。使用CT方法治疗结果表明，在大量的目标，标准化的范围内，相对以较准，得到22DDCT[5]。 细胞周期和死亡的分析—流式细胞仪 治疗后要确定细胞周期，我们染色细胞（106个细胞/条件），50毫克的碘化，随后用荧光激活细胞分选（流式细胞仪）分析DNA含量。使用ModFit软件对所有细胞周期的结果进行分析。使用FIT计算相关的细胞周期分布，对所有的样品采用同样的操作。我们使用Vybrant凋亡检测试剂盒#2（盒）（105细胞/条件）来确定细胞死亡。采用流式细胞仪（美国贝克曼库尔特）和细胞Quest 软件进行细胞周期分布和细胞死亡检测。各种情况下都进行同样的试验。 动物试验 使用HT29各种小鼠模型调查抗坏血酸的抑制行动，小鼠健康状况符合我们机构的动物福利指标，试验开始前取得了当地动物伦理委员会的批准。4岁的雌性BalbC裸鼠（Charles River公司，法国里昂）（7例为组）对右翼皮下接种16106 HT29 细胞。植入后十天，一旦形成了肿瘤细胞大小，可准确测量，用一下剂量的AA对小鼠进行治疗：15毫克/千克，100毫克/千克，或1000毫克/千克。每天给药持续一个月。使用卡尺没两天从三个方面测量肿瘤细胞的大小，使用椭圆形的概略肿块计算肿瘤重量评价：m=P/长66宽6高6。治疗30天后研究终止。幸存的小鼠进行肿瘤重量评价。此外，日期及一些幸存的动物生存记录的分析。 统计分析 我们用棱镜第五版软件进行统计分析，采用置信区间为0.95的Mann-Whitney双尾统计显著性检验进行肿瘤重量分析。用Kaplan-Meier法和对数秩检验方法进行生存研究。我们认为使P值小于0.05很重要。 结果 AA和基因表达 进行治疗24小时原代培养的正常人成纤维细胞有三个AA不同浓度，范围从0.3-0.8mM。然后进行RNA的提取，反转录，在AGILENT pangenomic芯片进行杂交。用Cy3标记未经处理的细胞的RNA的样品，用Cy5标记那些处理过的细胞样品。在互换试验中，染料标签被交换，因此，未经处理的细胞被标记Cy5和处理的细胞被标记Cy3。基因，在最初阶段过高或过低的表达，在第二个阶段选择表达行为（例如，第一阶段表达较少，第二阶段过高表达），其中包括在minilibrary。使用Rosetta的生物信息学软件进行数据分析。我们认为惟一的基因，在相同的方向变动（过高或过低表达）在所有这三个芯片，一个P值，0.05。使用这些严格的标准，我们发现，在含有AA的细胞培养液里只有少数几个基因的表达，没有一个明显的生物学功能。与此相反，31基因似乎是下调（表一）。这31个基因中，12个编码蛋白质的基因中占有2个：酰tRNA合成酶和翻译起始因子亚基（图1A）。使用定量PCR（图1B）证实了这些数据。 A