实验一精子的制片活力及密度测定..doc

实验一 精子的制片、活力及密度测定 一 目的 1掌握小鼠精子的制片方法。 2. 了解评定精液品质的方法。 3. 掌握精子活力的估测方法及血球计数器进行精子密度测定的方法。 二 小鼠精子制片及观察 1.眼科手术剪、镊子、玻璃平皿、显微镜、擦镜纸、带橡皮头吸管载玻片盖玻片生理盐水、甲醇（分析纯）、2%伊红溶液 . 动物选择 成熟的大鼠、小鼠均可使用。一般采用雄性小鼠，年龄6-8周。 . 制片 用颈椎脱臼法处死小鼠，剪开腹腔，分离并摘取双侧附睾，将附睾放入盛有约3ml的生理盐水平皿中，以眼科将附睾剪成小块，用吸管将悬液轻轻吹打5-6次，静置3-5分钟，用四层擦镜纸滤除组织碎片，制得精子悬液。左手食指和拇指向上捏住载玻片两端，使载玻片处于水平状态，取此精子悬液滴至载玻片右侧。右手拿一载玻片或盖玻片，使其与左手拿的载玻片呈向右的45度角，并使其接触面在精液滴的左侧。将载玻片向右拉至精液刚好进入两载玻片形成的角缝中，然后平稳地推至左边（不得再向回拉），做成精液抹片。必须注意精液抹片不要太厚，同时要防止用力过大而造成人为的畸形精子数增多。抹片后，使其自然风干。晾干后用甲醇固定5分钟，干燥后即可镜检。也可用2%的伊红溶液染色1-2小时后再做镜检。 精液品质检查 (一) 直观检查 2. 观察精液的色泽并嗅闻气味。 色泽：正常精液一般为乳白色或白色，密度越高，乳白色程度越浓，其透明度也越低。其它颜色均为不正常颜色。一般为无味或略带腥味。 1. 目测评定法 是采用显微镜放大100-400倍下判断活力。这种评定方法完全是凭检查者的主观经验评定，可以在显微镜上装置闭路电视或显微镜投影法反映在荧屏上。评定精子活率等级，通常采用十级评定法，即按视野中呈直线前进运动的精子数占总精子数的估计百分比评定，100%直线前进运动者评为1.0，90%者评为0.9，80%者评为0.8，以下类推。检查时，取一滴精液于载玻片上制成压片标本，放在400倍显微镜下观察，浓度大的精液先用生理盐水或等渗稀释液稀释后检查。前进运动的精子占总精子数的比例不低于70%，即活力不低于0.7方可作进一步处理。 2. 血细胞计数器计数法 3 找到计数室和第一个中方格：将计数板固定在显微镜的推进器内，用100倍放大找到计数室，再用400倍找到计数室的第一个中方格。 4 计数精子：计数左上角至右下角五个中方格的总精子数，以精子的头部为准，依数上不数下，数左右不数右的原则进行计数位于格线上的精子，计数顺序从中方格第一排小格向右，至第二排向左，第三排向右，第四排向左。 为了减少误差，必须进行两次计数，如果前后两次误差大于10％，应作第三次检查。最后在三次检查中取两次误差不超过10％，求出平均数，即为所确定的精子数。 计算精子密度：精子密度=5个中方格总精子数×5×10000×稀释倍数 如5个中方格的总精子数是95，则精子密度=95×5×10000×200=9.5亿/ml一 目的 1. 掌握鉴别死活精子的操作技术，以此来评定精液品质的优劣。 掌握区别各种畸形精子的方法。 二 死、活精子的鉴1. 原理 死活精子测定也是目前常用用来评定精子活力的一种方法。主要根据死精子和活精子对染色剂亲和力不同的特性，采用特殊的染色方法，来区别死活精子的比例。通常采用苯胺黑---伊红染色法，死精子能染上粉红色，而活精子则不着色。 应用染色法仅能区别精子的死活，而不能正确的表明精子的运动情况，因为具有旋转运动和摆动的精子仍属于活精子，所以用此法评定精子活力的结果，往往要比直接观察精子活力的方法要高一个等级。 2. 仪器和试剂 眼科手术剪、眼科镊子、玻璃平皿、显微镜、擦镜纸、带橡皮头吸管，载玻片，盖玻片、5%伊红溶液，10%苯胺黑溶液0.5％的龙胆紫酒精液3. 操作步骤 3.1 取一滴精液，一滴5%伊红溶液和2滴10%的苯胺黑溶液与载玻片上（最好保持35℃），然后用玻棒将精液与伊红溶液迅速融合，再混入10%的苯胺黑溶液，搅拌数秒后，再取混合的精液一小滴，置于另一张载玻片的一端，用一张边缘平整的载玻片，成约35度角度与精液接触，待精液沿接触面扩散后，均匀地用力推至载玻片的另一端，做成精液抹片。 3.2 将做好的精液抹片至于显微镜下放大400倍进行观察。在苯胺黑的背景上，可清晰的看出死精子染成粉红色，活精子头部为无色透明。一般精子死亡时间越长，它的着色越深。 3.3 计算死、活精子的百分数：随机观察不同时也中的精子500个，然后按下列公式计算出死活精子的百分数： 死精子的百分数= （死精子数/计数的总精子数）×100% 二 畸形精子观察及百分率测定 在正常的精液中总是存在一些畸形精子的，凡是形态属于不正常的精子，统称为畸形精子。畸形精子的种类很多，一般常见的有头部膨大、头部小于正常大小、双头、头部不完整尾部残缺、折回、尾部卷