骨髓间充质干细胞移植治疗缺血性心脏病的实验理论探索.docVIP

骨髓间充质干细胞移植治疗缺血性心脏病的实验理论探索 　　【中图分类号】R68 【文献标识码】A 【文章编号】2095-6851（2017）03-0-01 　　缺血性心脏病（ischemic heart disease，IHD），即冠状动脉粥样硬化性心脏（coronary atherosclerotic heart disease ），指冠状动脉粥样硬化或（和）冠状动脉功能性改变使血管腔狭窄或阻塞，导致心肌缺血缺氧或坏死而引起的心脏病。随着经皮冠状动脉介入治疗（Percutaneous coronary intervention ，PCI）和冠状动脉搭桥术（CABG）广泛应用于临床，IHD治疗效果明显，但对于严重的IHD，如弥散性病变及梗死区远端心肌坏死、血管阻塞等，通过现有治疗手段患者即使可以渡过急性期，因心肌再生能力不足，坏死心肌纤维化、瘢痕化仍不可逆转，导致心力衰竭等严重并发症的发生。近年，干细胞移植研究给心血管疾病带来了新的曙光。其中，骨髓间充质干细胞（陈雨bonemarrow mesenchymal stem cells， BMSCs ）由于其来源广泛、容易获取、扩增能力强、多项分化潜能、易与宿主细胞建立联系及免疫原性低、能归巢、无医学伦理学争议等[1]优越性被大量前临床研究用于缺血性心脏病的细胞治疗。 　　1.骨髓间充质干细胞（bonemarrowmesenchymalstemcells，BMSCs）的概述： 　　血BMSCs属于骨髓干细胞中的一种，具有高度自我更新能力和多向分化能力的成体干细胞群体，最早于1987年，Friendenstein等[2]?l现在塑料培养皿中培养的贴壁的骨髓单个核细胞在一定条件下可分化成为成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞和成肌细胞，而且这些细胞经过20～30个培养周期后仍能保持其多向分化潜能；研究显示，人BMSCs在体外用5-氮胞苷（5-aza）处理24小时后可诱导成心肌细胞[3]Wang等人观察到在“环境诱导分化“的作用下，不经5-aza处理的BMSCs在体内可分化为心肌细胞并与宿主心肌细胞之间形成闰盘联系[4]。该类骨髓间充质干细胞不表达造血细胞系标记CD14、CD34、CD45及CD133，不表达内皮细胞系标记如vonWillebrand因子、P选择蛋白，而表达CD105、CD90及CD166抗原。后来的研究发现在体外培养条件下，BMSCs还具有向其他胚层细胞方向分化的能力，如肌腱、脂肪、肌肉、内皮、神经及心肌细胞等[5][6]。 　　2.取材： 　　不同组织来源的间充质干细胞的表型、增值分化能力和基因表达有一定差异，骨髓间充质干细胞占有核细胞总数的0.001%―0.010%，并随着年龄的增大而减少[7]，为实验研究的方便性和可行性，宜取幼龄小型哺乳动物的长骨骨髓。 　　3.分离纯化及鉴定 　　目前对于骨髓间充质干细胞的分离纯化常用的方法有：贴壁细胞离心法、密度梯度离心法、流式细胞仪法与免疫磁珠分离法等。贴壁细胞分离法是根据骨髓间充质干细胞贴壁生长的特性，通过反复换液去除悬浮细胞，使其与造血干细胞分离。培养所得的原代骨髓间充质干细胞贴壁增殖快，细胞活性高，缺点是所得细胞成分复杂，分离难度高。密度梯度离心法是根据骨髓间充质干细胞与其他细胞的密度差异进行细胞分离。这种方法与贴壁分离法结合，分离得到的细胞纯度相对更高，获得广泛采用。免疫磁珠分离法是利用的表面特异性抗原，利用免疫磁珠进行分离，它是目前所能获得BMSCs纯度最高的方法。[8]但由于BMSCs表面缺乏特异性标志，及分选后的细胞出现了增殖缓慢等问题，而且费用昂贵、操纵复杂、目前应用较少[9]。由于间充质干细胞表面具有多种标记物，但目前尚未筛选到独有的标志分子，给间充质干细胞的鉴定带来可一定的困难，2006年，国际细胞治疗协会提出了关于间充质干细胞鉴定的最低标准，包括3方面内容：在标准培养条件下能贴塑料瓶壁生长。95%以上的细胞表达CD105、CD73、CD90，同时95%以上的细胞不表达CD45、CD14或CD11b、CD79a或HLA-DR。能分化为骨细胞、脂肪细胞及软骨细胞。 　　4.预处理： 　　4.1 低氧处理：间充质干细胞在培养基中一般呈单细胞层生长，在低氧条件下，其增扩率可增加30倍。低氧条件下预处理BMSCs能增强BMSCs对心肌细胞凋亡的保护作用。 　　4.2 基因转染MSCs：目前认为血管内皮生长因子（VEGF）是最有效刺激血管生成的细胞因子之一，人类至少有4种VEGF，分别由121、165、189和206个氨基酸组成，其中VEGF165是发挥生物学效应的主要成分。Carmeliet等人发现VEGF表达水平对获得性血管生成是非常重要的。VEGF基因转染的MSCs能分泌较高水平的VEGF。研究