双歧杆菌及嗜酸乳杆菌二联活菌微胶囊研制.doc

双歧杆菌及嗜酸乳杆菌二联活菌微胶囊研制摘要：目的制备长双歧杆菌和嗜酸乳杆菌二联活菌微胶囊，以期提高口服时的存活率和常温下的保存期。方法根据微胶囊在人工胃液中的耐酸性和在人工肠液中的崩解性，确定空气悬浮法制备微胶囊的最佳工艺条件。扫描电镜观察微胶囊形态与大小。根据恒温37℃、相对湿度60％～65％条件下贮存3个月后菌体存活率，考察其贮存稳定性。结果制备的微胶囊具有良好的耐酸性和肠溶性。微胶囊包囊产率56.49％，包囊效率87.45％。微胶囊表面覆盖着一层光滑平整的囊膜，粒径大小基本在400～500μm。加保护剂的微胶囊菌体存活率高于10％，且远远高于冻干菌粉和无保护剂微胶囊组。结论确定了空气悬浮法制备长双歧杆菌和嗜酸乳杆菌二联活菌微胶囊的最佳工艺条件，微胶囊化有利于提高活菌的稳定性。 关键词：双歧杆菌；嗜酸乳杆菌；微胶囊 中图分类号：R944.9文献标识码：A文章编号： 1672?979X(2009)07?0011?06 目前多数微生态活菌制剂存在以下两个亟待解决的问题：制剂经口服时，活菌因不耐胃酸、胆汁和消化酶等的作用而极易失活；双歧杆菌等厌氧菌易受外界环境因素(如氧气、温度)的影响[2]，常温下货架寿命短，要求在低温下保存销售，因而影响了此类产品的生产、销售和应用。目前微胶囊技术是保护菌体活力最有效和实用的方法，该技术是利用天然或合成的高分子材料，将固体、液体甚至是气体的微小颗粒包裹在直径从小于1μm至5000μm的半透性或密封囊膜的微型胶囊内[1]。由于微胶囊内的物质与外界隔离，可免受外界不利环境的影响，若采用肠溶性囊材，还可避免口服时胃液的破坏[3]。 空气悬浮法(又称流化床法)制备微胶囊，是将固体囊心物悬浮于由流化床产生的承载气流中，呈沸腾状。囊液由喷嘴喷出，雾化形成微液滴，在囊室与悬浮的囊心物相遇，液滴在囊心物表面铺展并相互结合。由于气体的不断流动，溶解囊材的有机溶剂迅速挥发，聚合物在囊心物表面形成囊衣。被包囊的颗粒随气流在囊室循环，完成包囊与固化过程[4]。 本研究将空气悬浮微胶囊技术应用于微生态制剂，将长双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、保护剂和双歧因子包封于肠溶囊膜内，制成长双歧杆菌和嗜酸乳杆菌二联活菌制剂，以期提高口服时的菌体存活率和常温下的保存期。 1材料 1.1菌种 长双歧杆菌(Bifitdobacteriumlongum，简称BL，CICC6068)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus，简称LA，CICC6005)：购自中国工业微生物菌种保藏中心。 1.2培养基 长双歧杆菌：大豆蛋白胨0.5g，胰蛋白胨0.5g，酵母粉1.0g，葡萄糖1.0g，低聚木糖0.5g，无机盐溶液4mL，蒸馏水100mL，盐酸半胱氨酸0.05g(培养基热沸后加入)，调pH7.0，121℃灭菌15min。固体斜面加琼脂1.5～2.0g。上述无机盐溶液：CaCl20.2g，MgSO47H2O0.48g，K2HPO41.0g，KH2PO41.0g，NaHCO310g，NaCl2g。混合CaCl2和MgSO4在300mL蒸馏水中溶解，加蒸馏水500mL，边搅拌边缓慢加入其它盐类至溶解，加蒸馏水200mL混匀。 嗜酸乳杆菌：蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，柠檬酸氢二铵2g，葡萄糖20g，吐温801mL，CH3COONa3H2O5g，K2HPO43H2O2g，MgSO47H2O0.58g，MnSO4H2O0.25g，蒸馏水1000mL，调pH6.2～6.4，121℃灭菌15min。固体斜面加琼脂15～18g。 1.3试剂 海藻糖：纯度99％(日本林原商事)；透明质酸(HA)：Mr=2.0×106，批山东福瑞达生物化工)；脱脂乳粉(黑龙江完达山乳业)；聚丙烯酸树脂Ⅱ(泰安明天化工)。 1.4仪器 YQX?II厌氧培养箱(上海新苗医疗器械公司)；FreeZone6L冷冻干燥机(美国Labconco公司)；CR20B2高速冷冻离心机(日本HITACHI公司)；流化床包衣机(沈阳药科大学提供)；SPX?150恒温培养箱(北京市永光明医疗仪器厂)；S?520扫描电子显微镜(日本HITACHI公司)。 2方法 2.1冻干菌粉的制备 长双歧杆菌、嗜酸乳杆菌菌种分别活化，接种，37℃培养20h，于4℃、5000r/min离心10min收集菌体，湿菌体与保护剂和双歧杆菌增生促进剂低聚木糖溶液混和均匀，得菌悬液，冷冻干燥得冻干菌粉。冻干菌粉磨碎、筛分，将长双歧杆菌和嗜酸乳杆菌2种菌粉等量混合，备用。保护剂的配方及其与菌泥的比例为：10％海藻糖、0.6％HA和20％脱脂乳粉(长双歧杆菌)或10％海藻糖、0.2