四妙勇安汤对人脐静脉血管内皮细胞ECV304增殖作用.docVIP

四妙勇安汤对人脐静脉血管内皮细胞ECV304增殖作用摘要：目的：以血清药理学的方法观察血四妙勇安汤对于培养人脐静脉内皮细胞ECV304增殖的影响，为治疗性血管新生的靶基因选择提供线索。方法：取对数生长期的内皮细胞，同步化于G0期，ELISA法检测BrdU的掺入：用流式细胞仪分析细胞周期各时相分布。结果：与空白血清对照组相比，10％的四妙勇安汤合药血清体积添加分数可显著提高BrdU的掺入量，促进DNA合成，提高ECV304细胞周期S期所占比例。结论：10％的四妙勇安汤含药血清能促进内皮细胞ECV304 DNA合成，加快细胞周期进程，从而对其增殖具有促进的作用，可能具有血管生成的作用。 关键词：四妙勇安汤；血管内皮细胞；增殖；细胞周期 中图分类号：R285.5　文献标识码：A　文章编号：1673－7717(2007)09－1818－03 缺血性疾患(如晚期冠状动脉病变、糖尿病足)严重威胁着人类健康，也成为我国病死率和病残率不断上升的主要原因。Hockel等认针对缺血性疾病的治疗提出了“治疗性血管生成”的概念。此概念提出后被应用于缺血性疾病的治疗中。在血管形成过程有许多关键步骤，包括内皮细胞活化、增殖、迁移、中空的管腔形成等。不难看出，血管内皮细胞的增殖是血管管腔――这一实体形成的结构基础。四妙勇安汤是一首具有清热解毒、活血通络功效、治疗脱疽的古方，既往研究发现此方对心血管系统疾病疗效肯定，为进一步为其临床应用提供实验依据，本研究观察了四妙勇安汤对人脐静脉内皮细胞ECV304增殖作用的影响。 1　材料与方法 1．1材料与试剂 DMEM/F12干粉(Gibeo公司，胎牛血清(FBS，中美合资兰州民海生物工程有限公司，A911001.104)，10000U/mL青霉索、10000μg/mL链霉索(Hyclone公司，SV30010)，胰蛋白酶(Gibco公司，BrdU试剂盒(BoehringerMannheim公司，11647229001)，EVC304细胞株(由天津市神经外科研究所张文治教授惠赠)。 1．2　含四妙勇安汤人血清的制备 金银花、玄参、当归、甘草，共11剂，按原方准确称取每味中药，加入15倍量的去离子水(即1g药加15mL去离子水)煎煮1.5h，冷却，滤出药渣，将四妙勇安汤水煎液以常规量，给健康志愿者连续服用5天，开始每日1次，连续服用3天后，于采集血液前30、24、18、12、6、3、1.5、0.5h连续8次间断服药，共计11次，静脉采血，以3000r/min离心15min，取上层血清，以0.22μm微孔滤膜过滤，制成人含药血清(HDS)备用，同时采集志愿者未服药时的血液制作对照组用血清(HNS)，以上血清均56℃水浴灭活30min后使用。 1．3　ECV304细胞的复苏及传代培养 将液氮中冻存的ECV304细胞株取出，迅速置于40℃水中，溶解后加D－hanks中，离心，去上清液，加入含10％胎牛血清(FBS)及1％双抗的DMEM/F12培养基中培养，置于5％CO2、37℃饱和湿度孵箱培养，长成80％融合状态时即可传代。传代时，弃去原培养液，加入0.25％胰蛋白酶溶液和0.02％EDTA的1:1混合液约5mL，消化1 min。加入新鲜含10％胎牛血清的DMEM/F12培养液终止消化反应。调整成密度约1.5×103个/mL的细胞悬液，转入新的培养瓶中。 实验分为：对照组(FBS组)：含10％FBS的DMEM/F12培养液。空白血清对照组(HNS组)：含10％健康人血清的DMEM/F12培养液。四妙勇安汤含药血清组(HDS组)：含10％的四妙勇安汤血清的DMEM/F12培养液。 1．4　BrdU－ELISA法测定细胞BrdU掺入 1．4．1　药物处理　取生长期的细胞均匀地接种于96孔板中，每孔100μL，约为2×104个细胞/mL，每组6个复孔。继续培养24h后，换含0.5％的FBS的培养液令细胞周期同步化，弃去原培养液，按实验分组更换培养液，继续培养24h。 1．4．2　实验步骤　100μmol/LBrdU标记液：用无菌DM－DM/F12培养液以1:100稀释原10mmol/LBrdU标记溶剂，使终浓度为100μmol/L。Anti－BrdU－POD抗体工作液：用双燕水1.1mL溶解Anti－BrdU－POD粉剂10min，充分混匀制成抗体储存液。实验时用抗体稀释液将储存液稀释100倍使用。PBS洗涤液：用双蒸水将10×PBS储存液稀释10倍。对照孔设置：每次实验均设2个空白对照孔(以DMEM培养液代替细胞)和1个BrdU背景对照孔(含细胞，但不加BrdU标记液，余步骤不变)，上述对照孔吸光值均应＜0