复合因子法建立大鼠肝纤维化模型实验探究.docVIP

复合因子法建立大鼠肝纤维化模型实验探究摘 要 目的:采用复合因子法建立健康SD雄性大鼠肝纤维化模型，探讨复合因子法建立肝纤维化模型的应用价值。方法:于0周、2周、4周、6周分别对以复合因子所建立大鼠肝纤维化模型进行肝组织病理检查及血清纤维化指标检查，以病理诊断结果为标准，探讨复合因子法建立肝纤维化模型的应用价值。结果：以复合因子法成功建立了鼠肝纤维化模型，该模型肝组织病理检查与血清纤维化指标检查相关性良好。结论:复合因子法建立健康SD雄性大鼠肝纤维化模型成功率较高，有较高的应用价值。 肝纤维化动物模型的制作方法较多，根据不同的实验目的选用的动物和模型制作方法也不同[1]。文献报道较多，经常应用的经典方法为四氯化碳制作肝纤维化模型法,选择的实验动物主要是小白鼠或大白鼠。本实验采用复合因子法建立健康SD雄性大鼠肝纤维化模型，探讨复合因子法建立肝纤维化模型的应用价值。 资料与方法 肝纤维化模型准备： 实验材料：①实验动物：健康雄性Sprague-Dawley大鼠，购自包头医学院实验动物中心。②实验试剂：四氯化碳，99.9％分析纯；10％乙醇。 肝纤维化模型制作：四氯化碳复合肝纤维化模型制备方法：健康清洁级雄性SD(Sprague-Dawley)大鼠38只，体质量150~220g，平均180g，随机分5组，根据文献报道方法采用复合因子致肝纤维化模型方法，建立鼠肝纤维化模型。 造模方法：①以79.5％纯玉米粉加20％猪油、0.5％胆固醇制成低蛋白高脂肪高胆固醇混合饲料喂饲实验大鼠；②以10％乙醇为惟一饮用水喂饲实验大鼠；③第1次皮下注射40％四氯化碳石蜡油液0.5ml/100g，以后每隔3天0.3ml/100g重复皮下注射，为期6周。 病理标本制作：各阶段造模结束后，处死实验动物，取肝组织以10％甲醛固定，标本大小约1cm×1cm×1cm。常规石蜡连续切片，分别进行苏木精-伊红(HE)及Masson三色染色进行病理观察。 HE染色方法步骤：将处理好的组织切片分别依次进行脱蜡、水化、苏木精染色、酸酒精分化、细胞核返蓝、脱水及伊红染色等过程，树胶封片，光镜下观察。 Masson三色染色方法步骤：①切片脱蜡，按常规处理后用清水冲洗。②用Weigert液，Regaud苏木素染色5分钟。③流水稍洗。④1％盐酸酒精分化。⑤流水冲洗至蓝黑色。⑥丽春红酸性晶红液染色5分钟。⑦蒸馏水稍洗。⑧1％磷钼酸水洗溶液处理5分钟。⑨不用水洗，直接入苯胺蓝液或光绿液染5分钟。⑩蒸馏水洗。[11]1％冰醋酸处理1分钟。[12]95％酒精分化，无水酒精脱水。[13]二甲苯透明，中性树胶封固。 染色结果：Masson染色胶原纤维呈蓝绿色，细胞核呈蓝黑色。HE染色细胞浆、结缔组织等呈不同程度的红色。采用2000年[2]西安全国会议通过的纤维化分期分类标准(S0-4)，至少在光学显微镜下显示包括6个以上汇管区，由两位有经验的病理科医生分别观察做出最终纤维化诊断。纤维化程度分期诊断标准为：S-0期:无纤维化;S-1期:汇管区纤维化扩大，限局窦周及小叶内纤维化;S-2期:汇管区周围纤维化，纤维间隔形成，小叶结构保留;S-3期:小叶间隔伴小叶结构紊乱，无肝硬化；S-4期:早期肝硬化。 血清纤维化指标测定:麻醉下行心脏取血5ml，分离血清后置-40℃保存待检测，采用放射免疫法(HA放射免疫分析测定盒；LN放射免疫分析测定盒；均由上海海军医学研究所生物技术中心提供)。按各试剂盒说明采用放射免疫分析法，分别测定血清HA(单位μ/ml)、LN(单位μ/ml)、水平的变化。 统计学分析：所有计量资料均采用平均数±标准差(X±s)表示并代入统计，应用SPSS10.0统计软件，不同组分析采用多组间方差统计分析(F检验)，单因素相关分析采用spearman相关分析法。 结 果 肝纤维化实验模型的建立:本实验中采用复合方法制备鼠肝纤维化模型，用药后实验动物表现进食减少、体重减轻、活动减少，38只实验鼠除3只因耐受不良死亡外，存活35只纳入最终统计，存活率为92.1％。 实验病理结果：分别于造模2、4、6周时经病理检查证实获得不同程度的肝纤维化。肝脏病理组织学检查证实，随着造模时间的延长，肝纤维化程度逐渐加重。2周时以肝细胞脂肪变性，气球样变为主，并有少量纤维组织沉积，汇管区出现不同程度的炎症反应，淋巴细胞聚集；4周时除肝细胞脂肪变性，气球样变性仍明显外，胶原纤维沿肝板延伸呈纤维隔状，但无完整分界形成；6周时小叶间隔形成完整纤维隔，部分假小叶形成。Masson三色染色显示汇管区纤维组织沉积明显，汇管区变大，纤维间隔增粗，重度时纤维组织向肝小叶内部延伸分隔肝组织，呈现出早期假小叶的病理结构特征形成。 血清