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大黄素对HL-60细胞增殖及凋亡影响 摘 要：目的：探讨大黄素对人白血病细胞HL-60增殖及凋亡的影响。方法：应用MTT法检测大黄素对HL-60细胞增殖的影响；应用流式细胞术、DNA琼脂糖凝胶电泳观察和检测细胞凋亡；蛋白印迹法(Western-Blot)检测Bcl-2蛋白表达水平的变化。结果：在5～20mg/L浓度范围内，大黄素对HL-60细胞增殖的抑制作用呈时间剂量依赖性20mg/L作用72h后，抑制率分别达到（19.8±2.7）%，（58.8±4.4）%和（73.8±5.7）%；流式细胞术检测发现：大黄素5、10和20mg/L作用24h后，细胞凋亡率分别为（15.5±3.4）%、（56.0±3.4）%和（71.1±5.0）%，与对照组（1.01±0.06）%有显著性差异（P99%，用二甲基亚砜(DMSO), Sigma公司溶解, - 20℃； IMDM培养液购自Gibco公司；新生牛血清购自杭州四季青公司；四甲基偶氮唑蓝（MTT）和二甲基亚砜（DSMO）均购自Sigma公司；Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit购自Biovision公司；bcl-2抗体购自Santa Cruz公司。HL-60白血病细胞系为本研究所保存。 1.2 实验方法 1.2.1 细胞培养 人白血病细胞HL-60细胞悬浮含10%新生牛血清的IMDM培养液中，在37℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱内培养，每2～3天传代1次，取对数生长期细胞进行实验。 1.2.2 MTT法测定细胞增殖抑制率 取对数生长期的HL-60细胞，以1×105/mL的密度接种于96孔培养板中，每孔0.2mL，实验组：加5、10、20mg/L大黄素；对照组：加等体积的培养液；空白组：只加培养液，无细胞。每组设3个复孔。置37℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱内培养，分别培养24、48、72h，于终止培养前4h加入MTT溶液（5mg/ml）10μL，培养4h，离心，弃上清，加入150μL的DSMO，震荡5min，使结晶完全溶解。酶标仪于490nm处测量吸光值(OD)，取各组均值，重复实验3次。计算大黄素对HL-60细胞增殖抑制率。抑制率=\[（OD对照组-OD实验组）/ OD对照组\]×100%。 1.2.3 流式细胞术检测细胞凋亡 收集不同浓度大黄素（5、10、20mg/L）作用24h的HL-60细胞和对照组HL-60细胞，用预冷的PBS洗涤2次，重悬于结合缓冲夜（binding buffer）中，加Annexin V-FITC和PI，室温避光孵育15min，流式细胞仪检测。 1.2.4 DNA琼脂糖凝胶电泳分析 收集不同浓度大黄素（5、10、20mg/L）作用24h的HL-60细胞和对照组HL-60细胞，PBS洗涤，提取DNA，1.5%琼脂糖凝胶电泳，80V，2h，紫外灯下检测并摄像。 1.2.5 Western blot检测Bcl-2蛋白 收集不同浓度大黄素作用 24h及对照组细胞 , PBS洗涤后，入裂解缓冲液 , 4℃孵育30min，12000r/min离心5min，取上清，测定蛋白含量。取20μg蛋白样品，进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳，电转移至硝酸纤维素膜上，1.2%BSA封闭后，加入一抗，室温1.5h，TBST洗膜3次，再加入二抗，室温孵育1h，TBST洗膜3次。ECL发光检测，X光片显影。 1.2.6 统计学处理 采用SPSS 10.0统计学软件进行方差分析，数据以均数±s标准差表示。 2 结 果 2.1 大黄素对HL-60细胞增殖的影响 大黄素作用24h后，HL-60细胞生长开始出现不同程度的抑制，20mg/L时抑制率为(19.8±2.7)%，与对照组相比有显著性差异（P0.05）。浓度为20mg/L时作用72h后，抑制率分别达到(19.8±2.7)%，(58.8±4.4)%和(73.8±5.7)%，随着药物浓度和时间增加，生长抑制率增加，抑制作用呈时间浓度依赖性。见图1。 图1 不同浓度大黄素对HL-60增殖抑制作用 2.2 流式细胞仪检测结果 经FCM检测发现，经不同浓度大黄素处理的HL-60细胞出现了不同程度的凋亡。而且随着浓度的增加，凋亡程度也越来越明显。当大黄素浓度为5、10和20mg/L时，细胞凋亡率分别为(15.5±3.4)%、(56.0±3.4)%和(71.1±50)%，与对照组（1.01±0.06）%有显著性差异（P005）。见图2。 A 对照组；B 大黄素5mg/L组；C 大黄素10mg/L组；D 大黄素20mg/L组 图2 大黄素作用HL-60细胞24h后FCM分析凋亡结果 2.3 DNA琼脂糖