六味地黄丸对大鼠前脂肪细胞增殖与分化的影响.docVIP

　　六味地黄丸对大鼠前脂肪细胞增殖与分化的影响 【关键词】 六味地黄丸；大鼠；前脂肪细胞；细胞增殖；细胞分化 　　Abstract：Objective To investigate the influence of Liu on proliferation of rat preadipocytes ethod, the influence of Liu on expression of GPDH ined by enzyme tissue chemical method, the effect on lipid accumulation ined by Oil Red O staining. Results Liu stimulated rat preadipocyte proliferation, inhibited GPDH up-regulation during differentiation, inhibited lipid accumulation in cell differentiation ulated rat preadipocyte proliferation, inhibited rat preadipocyte differentiation. 　　Key a公司；MTT(批号1313Bl1)购自Amresco公司；标准胎牛血清(批购自兰州民海生物工程有限公司；油红0(批号830120)购自北京夏新试剂分装厂。DMSO购自宜兴市化工厂；水为双蒸水；其余试剂均为分析纯。 　　1.2 动物 健康EM/低糖培养液5～10 mL,塞紧瓶塞,将底面翻转朝上。37 ℃、5% C02培养1～2 h,待粘附牢固后,翻转培养瓶做正常培养,每日观察。原代培养区域单层汇合达到约1/2瓶底面积后即可传代,取培养7代以内的大鼠前脂肪细胞用于实验。 　　2.6 油红O染色提取法测定脂肪细胞内脂肪含量 　　用PBS冲洗2～3次,加入10%的甲醛缓冲液室温下固定1 h,去固定液,加入油红O染色,室温下染色2 h,去染色剂,以无菌双蒸水冲洗2次,洗去未着色的染料,倒置显微镜下观察,照相。结束后,以异丙醇溶解,490 nm酶标仪下测吸光度,以吸光度(A值)表示,画出时间-A值曲线。结果前脂肪细胞内的脂肪含量在单层形成6～7 d后迅速增加,11 d左右到达高峰,与形态学上的单层汇合后1周左右细胞内出现脂肪颗粒完全吻合。细胞内脂肪含量的增加比GPDH的出现要晚6 d左右,说明酶的出现在先,脂肪出现在后。 　　2.7 分组及给药 　　将第4代的大鼠前脂肪细胞接种到96孔板,贴壁后于96孔培养板每6孔一组,分为4组：10%空白大鼠血清组,六味地黄丸药物血清高、中、低剂量组(浓度分别为10%、5%、2.5%,简称高、中、低剂量组)。上述各组所含血清的终浓度均为10%,血清含量不足者以空白大鼠血清补齐。 　　2.8 六味地黄丸对大鼠前脂肪细胞增殖的影响 　　配制大鼠前脂肪细胞增殖培养液：DMEM/低糖＋空白大鼠血清,分别与六味地黄丸含药血清共同溶解于培养液中,其终浓度同“2.7”项。取第4代的大鼠前脂肪细胞,以10 000个/孔接入96孔培养板中,37 ℃、5% C02培养12 h。分别加入上述配制的各种含药培养液,再培养48 h。将浓度为5 g/L MTT液与10%空白大鼠血清的DMEM培养液按体积(1∶9)配成MTT培养液。移出培养液,换上MTT培养液培养4 h,吸干培养液,每孔加100 μL DMSO,混匀后置酶标仪490 nm观测吸光度值,观察各浓度含药血清对前脂肪细胞增殖的影响,测定各孔吸光度(A值)。6复孔取平均值。实验数据以x±s表示,进行t检验。结果见表1。 　　2.9 六味地黄丸对大鼠前脂肪细胞分化过程中甘油磷酸脱氢酶的影响 　　配制大鼠前脂肪细胞分化培养液：DMEM/低糖＋空白大鼠血清＋胰岛素10 μmol/L＋地塞米松1 μmol/L.以分化培养液配制不同浓度六味地黄丸含药血清培养液,其终浓度同“2.7”。取第4代的细胞以30 000个/孔接种于96孔培养板中,37 ℃、5% CO2培养5 d,分别加入上述配制的各培养液,再培养5 d。培养结束后, 酶组织化学提取法测定GPDH的活性,紫外分光光度计340 nm波长处观测吸光度值。以吸光度(A值)间接表示酶的活性,6复孔取平均值。实验数据以x±s表示,进行统计分析。结果见表1。 　　2.10 六味地黄丸对大鼠前脂肪细胞分化过程中脂肪积聚的影响 　　培养液的配制同“2.7”项,取第3代的大鼠前脂肪细胞以30 000细胞/孔接种入96孔培养板中,于37 ℃、5% CO2培养10 d后,加入“2.7”项配制好的含药培养液,再于同样条件下培养5 d。培养结