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流式细胞仪检测的特异性细胞活性.pdf
· 1680 中国生物制品学杂志2012年 l2月第25卷第 12期 ChinJBiologicalsDecember2012,Vo1.25No.12
· 技术方法 ·
疫苗诱导的特异性细胞杀伤活性检测方法的建立
卫江波 ,徐然然2A,付志浩2郑秀玉 ,饶春明 ,高凯2杜丽芳 ,王军志2沈心亮
【摘要 】 目的 建立一种基于流式细胞术的评价疫苗诱导的特异性细胞杀伤活性的方法,以完善疫苗及基因治疗药物的
评价方法。方法 用羧基荧光素二乙酸盐琥珀酰亚胺酯(Carboxynuoresceindiacetate,succinimidylester,CFSE)标记淋巴细胞,利
用肿瘤坏死因子(Tum0rnecmsisfactor,TNFc~)模拟杀伤淋巴细胞,用碘化丙啶(Propidiumiodide,PI)染色,流式细胞仪检测 ,确定
CFSE和PI的浓度及作用时间。利用已确知有较强细胞免疫作用的治疗性乙型肝炎疫苗免疫小鼠,分离特异性淋巴细胞并用特
异性肽刺激,分离未免疫小鼠的淋巴细胞作为靶细胞 ,并用特异性抗原肽致敏,并从靶细胞的标记、效应细胞培养时间,效靶作
用时间、效靶比几方面进行优化 ,确定试验方法的操作流程。结果 采用 CFSE/PI双标记能有效分离实验所需各组群,细胞分
为CFSE*PI-,CFSE*PI+.CFSE-PP,CFSE-PI一4个组群,可区分活细胞和凋亡细胞。CFSE标记靶细胞的时间为6h;效应细胞培养时
间为72h;效靶作用时间为6h;效靶比可使用100:1和50:1。结论 建立了基于流式细胞术的评价疫苗诱导的特异性细胞杀
伤活性的方法,该方法可有效和精确地评价CTL杀伤效应,完善了疫苗及基因治疗药物的评价方法。
【关键词】 羧基荧光素二乙酸盐琥珀酰亚胺酯;碘化丙啶;流式细胞术;细胞毒杀伤作用
【中图分类号】R392.33 文【献标识码】A 【文章编号】1004—5503(2012)12.1680.04
Developmentofamethodfordeterminationofvaccine-inducedspecificcellularkillingactivity
WEIJiang—be。,XU Ran—ran,FU Zhi—hao,ZHENG Xiu-yu,RAO Chun-ming,GAO Kai,DU Li-fang,WANG
Jun—zhi,SHENXin-liang(NationalVaccineSerumInstitute,Beijing100024,China)
A【bstract】 Objective Todevelopamethodforevaluationofvaccine—inducedspecificcellularkillingactivitybasedonflow
cytometry(FCM)andperfectthemethodforassessmentofvaccineandgenetherapeuticdrugs.Methods Lymphocyteswerelabeled
withCFSE (carboxyfluoresceindiacetate,succinimidylester)andtreatedwithTNFatomimicthecytotoxiceffectofcytotoxickiller
cells,thendeterminedbyFCM afterpropidiumiodide(PI)staining,basedonwhichtheconcentrationsofCFSEandPIandtimeofr
treatmentwereoptimized.MicewereimmunizedwiththerapeutichepatitisBvaccinewithknownhighcellularimmunity,ofwhichthe
specificlymphocyteswereisolatedfrom spleenandstimulatedwithspecificpeptide.Thelymphocytesofunimmunizedmicewereiso—
latedastargetcellsandsensitizedwithspecificantigenicpeptide.A procedurewasdevelopedba
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