酵母菌的分离鉴定、固定化及酒精发酵3.doc

酵母菌的分离鉴定、固定化及酒精发酵酵母菌喜欢酸性环境乳酸豆芽葡萄糖培养富集培养然后在培养基上用划线法分离纯化出酵母菌。将分离的酵母菌转接于YPG斜面培养基上培养，待长好后置于冰箱内4 ℃下保存。用显色剂及杜氏小管观察法通过菌落形态、细胞形态及分子生物学手段进行鉴定PVA-海藻酸钠固定化技术进行酒精发酵Yeast like acid environment, the use of lactic acid glucose medium enrichment culture yeast, bean sprouts and purification by marking method on the YPG culture medium of yeast will transfer separation of the yeast in the YPG cant medium cultivation, staying long placed in the refrigerator after use the TTC chromogenic agent, save and duchenne tubular observation screen high fermentation ability by colony morphology of yeast cell morphological and biochemical analysis and molecular biology means to identify the microorganisms using PVA - sodium alginate immobilized technology fixed yeast cells for ethanol fermentation。 前言 酵母菌（yeast）是一类单细胞真菌。一般呈圆形、卵圆形、圆柱形，其菌落呈乳白色或红色，表面湿润、粘稠，易被挑起。酵母菌多数为腐生，专性或兼性好氧，广泛生长在偏酸性的潮湿的含糖环境中，例如水果、蔬菜、蜜饯的内部和表面以及在果园土壤中最为常见。酵母菌在有氧环境下将葡萄糖转化为水和二氧化碳，主要用于馒头、面包等食品发酵；在工业上，酿酒酵（Saccharomyces cerevisiae）将葡萄糖、果糖、甘露糖等单糖吸入细胞内，在无氧的条件下，经过体内酶的作用，把单糖分解为二氧化碳和酒精。此作用即酒精发酵。 C6H12O6(葡萄糖)2 C2H5OH(酒精)+2 CO2 在酿酒酵母酒精发酵的生产和应用中，由于细胞破碎和酶纯化等操作往往导致酶活性和稳定性都受影响，从而降低产酒精效率。而利用细胞固定化可以很好的解决这一问题。微生物细胞固定化方法主要有三种：载体结合法，交联法和包埋法，其中固定包埋法是目前比较理想的方法。包埋法就是将微生物细胞均匀地包埋在多孔的水不溶性的紧密结构中，细胞中的酶处于活化状态，因而活性高，活力耐久。目前，利用聚乙烯醇（PVA）—海藻酸盐是包埋法中比较高效的一种，这种方法以PVA-海藻酸钠作为混合溶胶，将酵母细胞固定起来进行酒精发酵，不仅可以使细胞浓度增加，而且可以多次使用，减少了酵母培养增殖所消耗的糖分；操作简单、过程迅速、颗粒不粘连、颗粒强度大大提高，且增加了颗粒的生物活性和稳定性，因此可实现连续化生产，提高酒精生产效率。 酵母膏、蛋白胨、葡萄糖、琼脂豆芽去离子水PVA 、海藻酸钠CaCl2、红糖异丙醇、乙醇、液氮、Taq酶、dNTPs、引物酵母膏，葡萄糖，(NH4)2SO4，K2HPO4?3H2O，MgSO4?7H2OH2SO4 ，1% K2Cr2O7 ，10% NaOH乳酸豆芽葡萄糖培养液豆芽（60 g）、葡萄糖（6 g）, pH 值4.5YPG培养基（500 ml）：酵母膏（5 g）、蛋白胨（10 g）、葡萄 糖（10 g）、琼脂（10 g）、pH值6.5～6.8。 TTC上层培养基TTC 0.05 g、葡萄糖0.5 g、琼脂1.5 g、水l00 ml酒精发酵培养液：红糖100 g， (NH4)2SO4 2.0 g，KH2PO4 1.0 g，pH自然去离子水1000 ml。 酒精计、试管杜氏小管、移液枪、滴管显微镜、三角瓶、烧杯、、玻璃棒、三角瓶、培养皿、试管、吸管、移液枪、漏斗、纱布、瓷缸、刮铲、载玻片、酒精灯、高压蒸汽灭菌锅、载玻片、盖玻片 1.2 实验方法 1.2.1 酵母菌的分离与培养 取葡萄皮于90 ml无菌水，放置于摇床150 rpm，摇晃5 min，取出后稍静置。用无菌枪头吸取上清液1 ml接入9 ml的乳酸豆芽葡萄糖培养液中，置28～30℃中培养小时置28～30 ℃再培养 h，得到酵母初筛单菌落，观察菌落镜检发酵菌株的筛选 倒入TTC上层培养基，30 ℃下