AssayProtocol(细胞培养试验流程).docVIP

Assay Protocol——细胞培养 一、仪器、试剂 仪器：培养瓶μl、10μl），移液离心机计数板水浴箱（37℃） CO2培养箱（调整至37℃）试剂：μl. 10ml Frozen Media：Complete Media 8ml； Serum 1ml； DMSO 1ml。 Puromycin(2μg/μl)：6μlPromycin/4ml CM 具体操作1. 准备：取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒0分钟℃冷藏拿出至室温待用（使用之前用75%酒精全面消毒）。开始工作前先洗手、75%酒精手至肘部。点燃酒精灯，安装。 ℃中等待，然后转移至-80℃冰箱中保存，并做好冻存记录。 注意事项: 严格无菌操作，打开/拧上瓶盖时一定要烧瓶口灭菌。 2.凡是带入超净工作台内的酒精、PBS、培养基、胰蛋白酶的瓶子均要用75％酒精擦拭瓶子的外表面，并靠近酒精灯火焰操作。 3.器皿使用前必须过火灭菌。 4.继续使用的器皿（如瓶盖、滴管）要放在高处，使用时仍要过火。 5.各种操作要靠近酒精灯，动作要轻、准确，不能乱碰。如吸管不能碰到废液缸。 6.吸取两种以上的使用液时要注意更换吸管，防止交叉污染。 四、细胞的冻存（补充） 1.先将冻存管放入4℃冰箱，约40min。 2.接着置于-20℃冰箱，约30-60min。 3.置于-80超低温冰箱（可保存半年）中放置过夜。 4.置于液氮罐中长期保存。 5同时做好冻存记录，在自己的笔记本和冻存记录本上均要记录。 6.不宜将冻存细胞放置在0℃～-60℃这一温度范围内过久，低温损伤主要发生在这一温度区内，是“危险温区”。补充1： 细胞复苏的原则 快速融化：必须将冻存在-196℃液氮中的细胞快速融化至37℃，使细胞外冻存时的冰晶迅速融化，避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶，对细胞造成损害。 具体操作 一. 实验前准备： 1.将水浴锅预热至37℃。 2.大 紫外线照射30min的超净工作台台面。 3.在超净工作台中按次序摆放好消过毒的离心管、枪头盒、培养瓶等。 二．取出冻存管： 1.根据细胞冻存记录按标签找到所需细胞的编号。 2.从液氮罐中取出细胞盒，取出所需的细胞，同时核对管外的编号。 三．迅速解冻： 1.迅速将冻存管投入到（注意：管口在液面以上避免染菌）已经预热的水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动，使管中的液体迅速融化。 2.彪 约1-2min后冻存管内液体完全溶解，再配平放入离心机中800r/min 离心5min后，取出后去除封口膜并用酒精喷拭冻存管的外壁和管口，用酒精灯烧瓶口后，小心吸弃冻存液，加入1ml Media，吹打制成细胞悬液，将细胞悬液分装入培养瓶内，加Media至4ml后，将培养瓶放入37℃和5%CO2的培养箱内培养，换液的时间由细胞情况而定。 补充2： 细胞计数 实验原理：当待测细胞悬液中细胞均匀分布时，通过测定一定体积悬液中的细胞的数目，即可换算出每毫升细胞悬液中细胞的细胞数目。 具体操作： 一.准备工作： 取一瓶传代的细胞，按照《传代细胞培养（消化法）》中的传代方法繁殖细胞，待长成单层后以被使用。 二.细胞悬液制备： 细胞悬液的制备方法是用PBS液洗涤、0.25％的胰蛋白酶液消化后，加入培养液，吹打制成待测细胞悬液。 三.细胞计数： 1.盖好盖玻片：取一套血球计数板，将特制的盖玻片盖在血球计数槽上。 2.cc 制备计数用的细胞悬液：用吸管吸5滴细胞悬液到一离心管中，加入5滴台盼蓝染液（0.4％）或苯胺黑，活细胞不会被染色，加入染液后就可以在显微镜下区别活细胞和死细胞。 3.将细胞悬液滴入计数板：将待测细胞悬液吹均匀，然后吸取少量悬液沿盖片边缘缓缓滴入，要保证盖片下充满悬液，注意盖片下不要有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中。 4.统计四个大格的细胞数：将血球计数板放于显微镜的低倍镜下观察，并移动计数板，当看到镜中出现计数方格后，数出四角的四个大格（每个大格含有16个中铬）中没有被染液染上色的细胞数目。 5.计算原细胞悬液的细胞数:按照下面公式计算细胞密度： （细胞悬液的细胞数）/ml＝（ 四个大格子细胞数/4) ×2×104 说明：公式中除以4因为计数了4个大格的细胞数。 公式中乘以2因为细胞悬液于染液是1：1稀释。 公式中乘以104因为计数板中每一个大格的体积为： 1.0mm（长）×1.0mm（宽）×0.1mm（高）＝0.1mm3 而 1ml＝1000mm3 四.细胞计数要点： 1.进行细胞计数时，要求悬液中细胞数目不低于104个/ml，如果细胞数目很少要进行离