热休克蛋白90促进糖尿病创面愈合作用探究.docVIP

热休克蛋白90促进糖尿病创面愈合作用探究[摘要]目的:研究HSP90在糖尿病性难愈创面中的作用。方法:在链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠背部做d=2cm的全层皮肤缺损模型,并随机分为四组:空白组(B组)、HSP90组(C组)、胰岛素组(D组)及HSP90与胰岛素联合用药组(E组)。另设一组正常大鼠同样在背部做d=2cm全层皮肤缺损模型作为对照组(A组),每组n=(5n1+n2)=20只,共100只大鼠,在创面形成后即时给予难愈创面药物治疗持续2天,A组则不治疗。于创面形成后第3天、第5天、第7天、第10天、第14天及第21天进行大体观察及活体取材做常规病理学观察,各时间点标本采用免疫组化ABC法观察HSP90,并计算其平均密度值及积分光密度值,观察其表达规律。结果:大体观察下,在计算第21天的创面愈合率后我们发现, C组(85.9%)、D组(86.8%)及E组(96.8%)相较于B组(79.7%)创面愈合率均有显著提高(P 1材料和方法 1.1动物及分组:选用健康清洁级雄性SD大鼠100只,由第四军医大学动物试验中心提供,体重(200±3)g,分为A、B、C、D、E五组,每组20只。A组为正常创面但不予以任何治疗,即对照组;B组为糖尿病大鼠难愈创面给予空白凡士林药膏治疗组,即空白组;C组为糖尿病大鼠难愈创面给予含有HSP90的凡士林药膏治疗组,即HSP90组(HSP90浓度:1μg/ml);D组为糖尿病大鼠难愈创面给予含有胰岛素的凡士林药膏治疗组(胰岛素浓度:30μg/ml)E组为糖尿病大鼠难愈创面给予含有HSP90及胰岛素的凡士林药膏治疗组,即联合用药组(E组,HSP90浓度:1μg/ml,胰岛素浓度:30μg/ml)。每组n=(5n1+n2)=20只,共100只大鼠, 1.1.1 构建2型糖尿病难愈创面模型:采用链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)法诱导2型糖尿病造模。各组提前4周高脂高糖饮食,饥饿12h后以40mg/kg腹腔注射STZ并维持高脂高糖饮食,并于注射后48h用强生稳步血糖仪检测空腹血糖(fasting blood glucose,FBG),FBG值16.7mmol/L,体重明显下降(50g)为造模成功[4]。三天后补注STZ(以10～20mg/kg体重剂量腹腔注射),并测量FBG值。切取全层皮肤暴露肉膜为准后以d=2cm的金属环间断缝合固定于创缘,防止创面挛缩。 1.1.2 给药及分组:A组不涂抹任何药物;B组为空白药膏;C组为含有浓度1μg/ml HSP90的药膏;D组为含有浓度30μg/ml胰岛素的药膏;E组为含有1μg/ml HSP90及30μg/ml胰岛素的药膏。各给药组均以外用涂抹局部给药,药膏均匀覆盖整个创面(约1g/次)为准(含有药物的药膏均委托金花生物制药集团有限公司完成)。HSP90的浓度为我们参考了Li.W试验中用于正常创面的治疗浓度后[3],并以15只糖尿病大鼠给予1μg/ml,5μg/ml,10μg/ml进行了简单的预实验,发现三种浓度的效果并无显著差异,所以取最小浓度。 6941, 2实验过程及观察设计 在创面形成后即时给予难愈创面药物治疗持续2天,A组则不治疗,动物创面予以暴露。创面的固定环会于创面形成后的第10天予以摘除,因为此时皮肤挛缩力量较大,会导致缝合线断裂,为统一标准予以摘除。并创面形成后第3天、第5天、第7天、第10天、第14天及第21天进行大体观察及活体取材做常规病理学观察,在第3天、第5天、第7天、第10天及第14天5个时间点各取n1=3个标本,而在第21天取n2=5个标本,各标本取材时取全层厚皮肤,保留创缘约1～2mm的正常皮肤。 2.1 大体观察指标:分别于用药后第3、5、7、10、14、21 进行大体拍照观察并采用ADOBE photoshop cs4 计算各时期的创面愈合率; 2.2 镜下观察指标:并于3、5、7、10、14、21天取创面标本,3、5、7、10、14天每组各时间点3只,21天时每组5只。皮肤标本剪成横断面,标本均用1%中性福尔马林固定,石蜡包埋,连续切片,分别进行HE染色、并使用ABC法进行HSP90的免疫组化染色。并采用image pro plus 6.0彩色图像分析系统, 每张切片选取5个有代表性的200倍视野,测量每个标本HSP90阳性表达密度及积分光密度IOD值的均值并记录。 2.3 数据统计:所得试验数据均采用SPSS11。文中数据以均数和标准差(x±s) 表示,并且对创面愈合率采用两个独立样本t检验进行比较。 3实验结果 3.1 大鼠创面愈合率差异比较:各组大鼠在各时间点创面愈合率比较见表1。由表可见,单独使用HSP90(C组